雷帕霉素通過Ca2+-CaMKⅡ介導(dǎo)mTORC1-2和PP2A-PTEN-Erk1-2信號網(wǎng)絡(luò)抑制hsBAFF激活B細(xì)胞分子機(jī)理研究.pdf

1、本文運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)、臺盼藍(lán)染色、細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTS分析、流式細(xì)胞分析、RNA干擾、Western blot等細(xì)胞學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)和方法，以Raji細(xì)胞、Daudi細(xì)胞、小鼠原代脾臟B細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，系統(tǒng)地研究了雷帕霉素抑制hsBAFF刺激B細(xì)胞增殖和存活;雷帕霉素抑制hsBAFF激活Erk1/2依賴的B細(xì)胞增殖和存活機(jī)理;雷帕霉素通過PP2A-Erk1/2信號通路抑制hsBAFF刺激B細(xì)胞增殖和存活機(jī)理;雷帕霉素通過抑制mTOR介導(dǎo)PP2A

2、-Erk1/2信號通路抑制hsBAFF刺激B細(xì)胞增殖和存活機(jī)理;雷帕霉素靶向mTORC1和mTORC2通路抑制hsBAFF刺激B細(xì)胞增殖和存活機(jī)理;雷帕霉素通過Ca2+-CaMKⅡ依賴的PTEN/Akt-Erk1/2信號通路抑制hsBAFF刺激B細(xì)胞增殖和存活機(jī)理。結(jié)果如下:
　　1、雷帕霉素抑制hsBAFF刺激B細(xì)胞增殖和存活
　　Raji細(xì)胞、Daudi細(xì)胞和/或小鼠原代脾臟B淋巴細(xì)胞在不同濃度hsBAFF(0.5-5μ

3、g/ml)刺激48h、或在不同雷帕霉素濃度(50-200ng/ml)預(yù)處理2h后經(jīng)2.5μg/ml hsBAFF刺激48h，采用MTS分析法、細(xì)胞增殖計(jì)數(shù)、臺盼藍(lán)染色分析和流式細(xì)胞分析分別評估細(xì)胞增殖和存活表現(xiàn)。結(jié)果顯示，hsBAFF以濃度依賴的方式促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和存活;雷帕霉素以濃度依賴方式削弱hsBAFF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和存活。提示:雷帕霉素能抑制hsBAFF刺激B細(xì)胞增殖和存活。
　　2、雷帕霉素抑制hsBAFF激活Erk1

4、/2依賴的B細(xì)胞增殖和存活
　　Raji細(xì)胞、Daudi細(xì)胞、小鼠原代脾臟B淋巴細(xì)胞在不同濃度雷帕霉素(50-200ng/ml)預(yù)處理2h后加2.5μg/ml hsBAFF處理12h、或用Erk1/2抑制劑PD98059(0.1-25μM)預(yù)處理1h后加2.5μg/ml hsBAFF處理12h、或聯(lián)合Erk1/2抑制劑U0126（5μM）、PD98059（10μM）1h預(yù)處理后經(jīng)hsBAFF（1和2.5μg/ml）刺激12h或48

5、h、或用雷帕霉素（50和100ng/ml）預(yù)處理2h，聯(lián)合PD98059（1和10μM）預(yù)處理1h之后加2.5μg/ml hsBAFF處理12h或48h;在一些情況下，采用腺病毒持續(xù)激活MKK1活性(Ad-MKK1-R4F)或鈍化MKK1活性(Ad-MKK1-K97M)、慢病毒干擾沉默Erk1/2（shRNA Erk1/2）感染的的Raji細(xì)胞用雷帕霉素（100ng/ml）預(yù)處理2h后加2.5μg/ml hsBAFF處理12h或48h。

6、結(jié)合MTS和細(xì)胞計(jì)數(shù)分析細(xì)胞增殖和存活表現(xiàn)，Western blot分析相關(guān)通路蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示，雷帕霉素以濃度依賴的方式抑制hsBAFF激活的Erk1/2通路;采用Erk1/2抑制劑PD98059，腺病毒鈍化MKK1活性，慢病毒沉默Erk1/2都強(qiáng)化了雷帕霉素對hsBAFF激活的Erk1/2通路及B細(xì)胞增殖和存活的抑制作用，而持續(xù)激活MKK1能抵抗雷帕霉素的抑制作用。提示:雷帕霉素能抑制hsBAFF激活Erk1/2依賴的B細(xì)胞增

7、殖和存活。
　　3、雷帕霉素通過PP2A-Erk1/2信號通路抑制hsBAFF刺激B細(xì)胞增殖和存活
　　Raji細(xì)胞、Daudi細(xì)胞和小鼠原代脾臟B淋巴細(xì)胞在不同濃度雷帕霉素(50-200ng/ml)預(yù)處理2h后加2.5μg/ml hsBAFF處理12h、或以100ng/ml雷帕霉素預(yù)處理2h，聯(lián)合PP2A抑制劑Okadaic acid(OA，100nM)預(yù)處理1h，再以2.5μg/ml的hsBAFF處理12h或48h;在一

8、些情況下，采用腺病毒鈍化PP2A或過表達(dá)上調(diào)PP2A活性，以100ng/ml雷帕霉素預(yù)處理2h，聯(lián)合Erk1/2抑制劑PD98059(10μM)預(yù)處理1h，再以2.5μg/ml的hsBAFF處理12h或48h。然后，評價(jià)B細(xì)胞PP2A活性、計(jì)數(shù)細(xì)胞和MTS分析評估細(xì)胞增殖和存活，以及Western blot檢測細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示，雷帕霉素抑制hsBAFF刺激升高的去甲基化和磷酸化PP2A且關(guān)聯(lián)著PP2A活性改變;PP2A抑制

9、劑OA抵抗雷帕霉素抑制hsBAFF刺激增加的p-Erk1/2和B細(xì)胞增殖和存活;過表達(dá)PP2A增強(qiáng)雷帕霉素抑制hsBAFF誘導(dǎo)的p-Erk1/2和B細(xì)胞增殖和存活;鈍化PP2A活性減弱雷帕霉素抑制作用。提示:雷帕霉素靶向PP2A抑制hsBAFF誘導(dǎo)B細(xì)胞Erk1/2通路激活及增殖和存活。
　　4、雷帕霉素通過抑制mTOR介導(dǎo)PP2A-Erk1/2信號通路抑制hsBAFF刺激B細(xì)胞增殖和存活
　　以Raji、Daudi和小鼠原

10、代脾臟B細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)研究對象，雷帕霉素100ng/ml預(yù)處理2h，再以2.5μg/ml hsBAFF處理12h或48h;采用異常表達(dá)抵抗雷帕霉素但有活性的腺病毒mTOR-T(Ad-mTOR-T)、抵抗雷帕霉素但無活性的腺病毒mTOR-TE(Ad-mTOR-TE)感染Raji細(xì)胞，或運(yùn)用慢病毒干擾沉默mTOR(shRNA mTOR)，雷帕霉素100ng/ml預(yù)處理2h，再以2.5μg/ml的hsBAFF處理12h或48h。然后，計(jì)數(shù)細(xì)胞和M

11、TS分析評估細(xì)胞增殖和存活，以及Western blot檢測細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示，雷帕霉素抑制B細(xì)胞增殖和存活涉及阻滯hsBAFF刺激S6K1/4E-BP1和Akt信號通路;雷帕霉素以mTOR激酶活性依賴的方式激活B細(xì)胞PP2A抑制hsBAFF誘導(dǎo)Erk1/2激活及細(xì)胞增殖和存活;下調(diào)mTOR阻滯hsBAFF誘導(dǎo)B細(xì)胞PP2A抑制和Erk1/2激活及細(xì)胞增殖和存活。提示:雷帕霉素通過阻滯mTOR介導(dǎo)PP2A-Erk1/2信號通

12、路抑制hsBAFF誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖和存活。
　　5、雷帕霉素靶向mTORC1和mTORC2通路抑制hsBAFF刺激B細(xì)胞增殖和存活
　　Raji細(xì)胞和/或小鼠原代脾臟B細(xì)胞在100ng/ml雷帕霉素和1μMPP242單獨(dú)預(yù)處理2h后，經(jīng)hsBAFF（2.5μg/ml）刺激12h或48h、或用100ng/ml雷帕霉素預(yù)處理2h，單獨(dú)或聯(lián)合20μM Akt抑制劑X預(yù)處理1h后經(jīng)hsBAFF(2.5μg/ml)刺激12h或48h;在

13、一些情況下用Ad-S6K1-wt、Ad-S6K1-ca、Ad-4EBP1-5A、Ad-myr-Akt、Ad-dn-Akt、shRNA Raptor、shRNA Rictor、shRNARaptor/Rictor、shRNA S6K1或shRNA4E-BP1感染Raji細(xì)胞，100ng/ml雷帕霉素或1μM PP242預(yù)處理2h后經(jīng)2.5μg/ml hsBAFF刺激12h或48h。然后，計(jì)數(shù)細(xì)胞和MTS分析評估細(xì)胞增殖和存活，以及West

14、ern blot檢測細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示，mTORC1和mTORC2涉及雷帕霉素對hsBAFF的抑制作用，這被在沉默Raptor、Rictor或Raptor/Rictor的細(xì)胞中呈現(xiàn)增強(qiáng)雷帕霉素抑制hsBAFF誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和存活的證據(jù)所支持;mTORC1/2的抑制劑PP242也能抑制hsBAFF誘導(dǎo)Survivin及細(xì)胞增殖和存活增加，并且這種抑制效果比雷帕霉素更有力;沉默S6K1、異常表達(dá)4EBP1-SA、鈍化Akt活性、或

15、和Akt抑制劑X聯(lián)合處理也強(qiáng)化雷帕霉素對hsBAFF誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖和存活的抑制作用，而S6K1-ca、沉默4EBP1、myr-Akt則削弱了雷帕霉素的抑制作用。提示:雷帕霉素靶向mTORC1介導(dǎo)的S6K1和4E-BP1通路及mTORC2介導(dǎo)的Akt通路抑制hsBAFF刺激B細(xì)胞增殖和存活。
　　6、雷帕霉素通過Ca2+-CaMKⅡ依賴的PTEN/Akt-Erk1/2信號通路抑制hsBAFF刺激B細(xì)胞增殖和存活
　　Raji細(xì)

16、胞和/或小鼠原代脾臟B細(xì)胞在100ng/ml雷帕霉素預(yù)處理2h，單獨(dú)或聯(lián)合20μM BAPTA/AM、100μM EGTA、100μM2-APB或10μM KN93預(yù)處理1h后經(jīng)hsBAFF(2.5μg/ml)刺激12h或48h;在一些情況下用Ad-PTEN、Ad-dn-Akt和shRNA CaMKⅡ感染Raji細(xì)胞，100ng/ml雷帕霉素預(yù)處理2h，20μM Akt抑制劑X或5μM U0126預(yù)處理1h后經(jīng)2.5μg/ml hsBA

17、FF刺激12h或48h。結(jié)合MTS和細(xì)胞計(jì)數(shù)分析細(xì)胞增殖和存活表現(xiàn)，Western blot分析相關(guān)通路蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示，過表達(dá)PTEN和鈍化Akt活性抑制了hsBAFF激活的p-Erk1/2、Bcl-2以及Survivin的增加，并且強(qiáng)化了雷帕霉素和Akt抑制劑X以及U0126對以上蛋白活性以及細(xì)胞增殖和存活的抑制;BAPTA/AM、EGTA、2-APB與雷帕霉素聯(lián)合或單獨(dú)處理均能抑制hsBAFF激活的p-PTEN、p-Akt、