APC-CCdc20對(duì)G2-M期Akt活性的調(diào)控作用.pdf

1、研究背景及目的：
　　Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在介導(dǎo)生長因子信號(hào)中發(fā)揮重要作用。Akt調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，在細(xì)胞存活、生長與增殖、糖代謝以及染色體穩(wěn)定性等生物過程中發(fā)揮重要功能。眾多研究已經(jīng)表明，Akt與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是介導(dǎo)腫瘤代謝Warburg效應(yīng)的重要分子，是一種重要的癌基因。因此，研究Akt蛋白激酶的分子調(diào)控機(jī)制具有重要的理論價(jià)值和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。盡管已有大量文獻(xiàn)報(bào)道G1-S期Akt相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)

2、控機(jī)制，但G2/M期Akt的分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚。APC/C泛素E3連接酶作為G2/M期細(xì)胞周期演進(jìn)的最主要調(diào)控分子復(fù)合體，通過 Cdc20和 Cdh1這兩個(gè)激活分子（Activator），分別識(shí)別底物分子的D-box、KEN-box序列，對(duì)底物分子進(jìn)行泛素化修飾，致使蛋白酶體依賴性的底物分子降解，促成細(xì)胞周期演進(jìn)。本研究旨在揭示G2/M期Akt活性變化，探討APC/C對(duì)Akt活性的調(diào)控作用及其分子機(jī)制。
　　研究方法：
　

3、　（1）用Nocodazole（諾考達(dá)唑）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行同步化處理，使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，采用流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM）加以驗(yàn)證。
　?。?）G2/M期同步化后的細(xì)胞繼續(xù)生長，使細(xì)胞進(jìn)入不同的細(xì)胞周期時(shí)相，采用免疫印跡法（immunoblot）檢測細(xì)胞周期不同時(shí)相Akt的活性。
　?。?）采用immunoblot檢測Cdh1和Cdc20在細(xì)胞周期不同時(shí)相中的表達(dá)水平。
　　（4）RNA干擾C

4、dh1和Cdc20表達(dá)水平后，采用immunoblot檢測干擾Cdh1和Cdc20的G2/M期Akt磷酸化水平的變化。
　?。?）為探索 Cdh1和 Cdc20調(diào)控 G2/M期 Akt活性的具體機(jī)制，采用immunoblot檢測Akt上游調(diào)控分子，包括PI3K各亞基以及mTORC2復(fù)合體各組成成分在 G2/M期的表達(dá)水平，并采用免疫共沉淀方法（Co-immunoprecipitiation, Co－IP）檢測mTORC2復(fù)合體形成

5、在G2/M期的變化。
　?。?）用 Etoposide（依托泊苷）處理同步化或未同步化的細(xì)胞，采用immunoblot和FCM方法比較細(xì)胞周期不同時(shí)相對(duì)細(xì)胞凋亡敏感性的影響。
　　研究結(jié)果：
　?。?）Akt在細(xì)胞周期的G2/M期位于S473和T308位點(diǎn)的磷酸化水平明顯降低，同時(shí)Cdh1和Cdc20在G2/M期表達(dá)高水平，提示APC/C可能參與G2/M期Akt活性的調(diào)控。
　?。?）G2/M期 mTORC2復(fù)合

6、體的形成減弱，為G2/M期Akt活性減低提供了機(jī)制解釋。
　?。?）干擾Cdc20后，G2/M期細(xì)胞Akt的磷酸化水平顯著增高。
　?。?）Akt的上游含有D-box或KEN-box序列的調(diào)控分子例如PI3K亞基以及mTORC2復(fù)合體各組分在G2/M期的表達(dá)水平與其它細(xì)胞周期時(shí)相相比無顯著區(qū)別，提示APC/C不是通過這些已知分子在G2/M期調(diào)控Akt的活性的，APC/C調(diào)控G2/M期Akt活性的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

7、r>　?。?）G2/M期Akt活性降低的細(xì)胞更容易發(fā)生Etoposide誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　研究結(jié)論：
　　G2/M期的Akt活性調(diào)控機(jī)制仍不甚明了。本研究發(fā)現(xiàn)G2/M期Akt S473和T308這兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化水平顯著下降，提示Akt活性在G2/M期的顯著下調(diào)。Akt在G2/M期活性的下降伴隨著mTORC2復(fù)合體形成減弱以及APC/C激活分子Cdc20和Cdh1表達(dá)增加，RNA干擾降低Cdc20的表達(dá)顯著增強(qiáng)G2/M期