低劑量3,3’-二吲哚甲烷通過(guò)調(diào)控Wnt4自分泌促進(jìn)胃癌進(jìn)展.pdf

1、目的：3,3’-二吲哚甲烷（DIM）對(duì)癌癥的治療作用已被證實(shí)，但不同劑量的DIM對(duì)胃癌是否有不同作用尚不清楚，本研究旨在探討低劑量的抗腫瘤藥物DIM對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移及腫瘤干細(xì)胞特性的影響及作用機(jī)制，為揭示低劑量DIM在胃癌中的作用提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)，同時(shí)也為DIM更好的應(yīng)用臨床提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和方法。
　　方法：應(yīng)用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)分析低劑量的DIM對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響，采用Western blot和免疫熒光檢測(cè)低劑量的DIM作用胃

2、癌細(xì)胞后增殖、遷移和干性相關(guān)蛋白及信號(hào)通路蛋白表達(dá)的變化情況。通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低劑量的DIM對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響。成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)分析低劑量的DIM對(duì)胃癌細(xì)胞成脂分化潛能的影響。聯(lián)合β-catenin通路抑制劑ICG001預(yù)處理，通過(guò)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、Western blot和成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證低劑量的DIM是否通過(guò)活化β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和增強(qiáng)其干性及分化潛能。采用TOP/FOP

3、Flash熒光蟲素酶報(bào)告基因檢測(cè)低劑量的DIM對(duì) Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化情況。構(gòu)建和包裝PORCN、WNT4以及GFP對(duì)照慢病毒shRNA,并轉(zhuǎn)染和篩選HGC-27穩(wěn)定細(xì)胞株。運(yùn)用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)PORCN、WNT4的敲減效率，通過(guò)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、Western blot、免疫熒光和成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)低劑量的DIM對(duì)PORCN、WNT4敲減后的HGC-27細(xì)胞增殖、遷移、干性及分化潛能的影響

4、。采用裸鼠皮下致瘤模型研究低劑量的DIM對(duì)胃癌細(xì)胞體內(nèi)致瘤能力的影響，qRT-PCR檢測(cè)瘤組織中Snail和N-cadherin的表達(dá)，免疫組化和免疫熒光檢測(cè)瘤組織中Wnt4、β-catenin和CD44的表達(dá)。
　　結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高劑量的DIM顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖，而低劑量的DIM能促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖蛋白PCNA和Cyclin-D3的表達(dá)、遷移相關(guān)蛋白N-cadherin、Vimentin的上調(diào)和E-cadherin的下調(diào)

5、，增強(qiáng)其干性蛋白CD44、Sall4、Oct4、Cmyc和Sox2的表達(dá)。研究顯示低劑量的DIM對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和干性的促進(jìn)作用與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化有關(guān)，且該作用可被β-catenin抑制劑ICG001所逆轉(zhuǎn)；干擾WNT分子自分泌后，DIM的這種作用即可逆轉(zhuǎn)，證明低劑量的DIM可能通過(guò)促進(jìn)WNT分子自分泌促進(jìn)胃癌干性及進(jìn)展；篩檢HGC-27細(xì)胞中WNT分子的表達(dá)發(fā)現(xiàn)WNT4明顯上調(diào)，將其敲減后，低劑量的DIM對(duì)