沉默信號調(diào)節(jié)因子及迷迭芳酸對鼻黏膜炎癥晚期炎癥因子HMGB1的影響作用.pdf

1、慢性鼻竇炎伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP）是鼻部常見病和多發(fā)病，歐洲鼻竇炎鼻息肉診療意見書(2012)報道慢性鼻竇炎患病率達(dá)10.9％，文獻(xiàn)報道鼻息肉術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)55％，嚴(yán)重影響患者生活和工作，加重了社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。CRSwNP是鼻腔鼻竇黏膜慢性炎性病變，研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病因素包括:感染、變態(tài)反應(yīng)、基因表達(dá)異常、細(xì)胞因子作用等(TNF-α、白介素以及白三烯等)。損傷相

2、關(guān)分子模式(DAMPs)是近年發(fā)現(xiàn)的炎癥誘導(dǎo)方式，與受體結(jié)合被免疫細(xì)胞識別后，刺激下游炎癥通路，釋放促炎因子，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，已知的DAMPs家族，包括PLUNC和HMGB1。前期研究發(fā)現(xiàn)高遷移率族蛋白1(HMGB1)，作為“晚期炎癥因子”，高表達(dá)于鼻息肉組織，脂多糖可誘導(dǎo)鼻黏膜上皮細(xì)胞核內(nèi)HMGB1主動遷移至胞質(zhì)，釋放至細(xì)胞外，其主動遷移過程與乙酰化作用相關(guān)，因而我們從具有去乙?；饔玫某聊盘栒{(diào)節(jié)因子著手，研究對鼻黏膜炎癥的影響作用。

3、
　　沉默信號調(diào)節(jié)因子(silent information regulator2，Sir2)是第三類組蛋白去乙?；福?個家族成員(Sirt-7)中Sirt1蛋白能通過減少細(xì)胞因子及減輕細(xì)胞因子作用于后產(chǎn)生的病理損傷來抑制炎癥反應(yīng)。在體外實驗中，鼻息肉和正常鼻黏膜組織中均有Sirt1表達(dá)，且正常鼻黏膜中Sirt1 mRNA水平比鼻息肉高5-7倍，但Sirt1在正常鼻黏膜及鼻息肉的發(fā)病機(jī)制中的作用尚未被闡述。該研究將通過體外鼻黏

4、膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)、siRNA干擾沉默Sirt1，探討在鼻黏膜炎癥過程中Sirt1如何調(diào)控HMGB1表達(dá)和釋放。
　　細(xì)胞外的HMGB1與toll樣受體(TLR4)結(jié)合導(dǎo)致NF-kB通路激活、絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號通路磷酸化，誘導(dǎo)炎癥因子釋放，HMGB1結(jié)合TLR4受體是其主要的炎癥反應(yīng)通路。迷迭香酸(rosmarinic acid，RA)，是一種酚酸類化合物，體外試驗中發(fā)現(xiàn)迷迭芳酸可以抑制toll樣受體和MAPKs信號

5、通路起到抑制炎癥的作用。還可通過抑制IκB激酶來抑制NF-κB信號通路，下調(diào)HMGB1的袁達(dá)，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)。本研究通過迷迭香酸作用于脂多糖誘導(dǎo)的原代鼻黏膜上皮細(xì)胞，觀察迷迭香酸在鼻黏膜炎癥反應(yīng)中的作用。
　　第一部分 沉默信號調(diào)節(jié)因子1對鼻黏膜炎癥晚期炎癥因子HMGB1的影響作用
　　目的:初步探討Sirt1對人鼻黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)、釋放HMGB1的影響作用。
　　方法:膠原蛋白酶消化鼻息肉標(biāo)本獲得原代人鼻黏膜上皮細(xì)

6、胞，經(jīng)體外培養(yǎng)、脂質(zhì)體介導(dǎo)的siRNA Sirt1轉(zhuǎn)染，分別于24h、48h后，利用RT-PCR檢測上皮細(xì)胞表達(dá)Sirt1 mRNA、HMGB1 mRNA，采用Western blot和免疫熒光染色觀察HMGB1在鼻黏膜上皮細(xì)胞的表達(dá)和定位。
　　結(jié)果:1.成功構(gòu)建pEGFP-N1-Sirt1真核表達(dá)質(zhì)粒，并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染建立鼻黏膜上皮細(xì)胞Sirt1過表達(dá)模型， Sirt1上調(diào)后，鼻黏膜上皮細(xì)胞HMGB1 mRNA及HMGB1蛋白

7、表達(dá)減少;2.轉(zhuǎn)染組鼻黏膜上皮細(xì)胞中Sirt1 mRNA表達(dá)低于對照組1.9倍(P=0.038)，HMGB1 mRNA表達(dá)高于對照組2.8倍(P=0.026)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;3.Sirt1蛋白水平在轉(zhuǎn)染組低于對照組2.1倍，HMGB1蛋白高于對照組1.8倍，P值均小于0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;4.免疫熒光染色提示:siRNA干擾沉默Sirt1后，鼻黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)、釋放HMGB1蛋白增多，并且由胞核向胞質(zhì)移位。
　　結(jié)論:1

8、.成功構(gòu)建了pEGFP-N1-sirt1真核表達(dá)質(zhì)粒，并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染建立Sirt1過表達(dá)模型;2.sirt1蛋白表達(dá)于鼻黏膜上皮細(xì)胞，siRNA對可抑制鼻黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)Sirt1蛋白;3.上調(diào)sirt1，HMGB1 mRNA及HMGB1蛋白表達(dá)減少，干擾沉默Sirt1后，HMGB1 mRNA及HMGB1蛋白表達(dá)增多，并且HMGB1由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)移位。Sirt1蛋白表達(dá)下調(diào)可能參與誘導(dǎo)鼻黏膜炎性反應(yīng)。
　　第二部分 迷迭芳酸對

9、脂多糖誘導(dǎo)鼻黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)HMGB1的影響作用
　　目的:初步探討迷迭香酸(RA)對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的鼻黏膜上皮細(xì)胞炎癥的影響和機(jī)制。
　　方法:膠原蛋白酶消化鼻息肉標(biāo)本獲得原代人鼻黏膜上皮細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)、脂多糖誘導(dǎo)48h后，更換含不同濃度迷迭香酸的培養(yǎng)基(0.9μM，8.1μM及27μM)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。MTT法檢測細(xì)胞增殖率，Westem blot觀察鼻黏膜上皮細(xì)胞中HMGB1蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:1.2

10、7μM RA細(xì)胞增殖率低于其他各濃度組，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2.Westem blot顯示與空白組相比，LPS誘導(dǎo)后鼻黏膜上皮中HMGB1蛋白表達(dá)明顯增加，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;與LPS組相比，0.9μM RA和8.1μMRA組中鼻黏膜上皮細(xì)胞的HMGB1表達(dá)明顯減少。
　　結(jié)論:低濃度(0.9μM和8.1μM)的迷迭香酸可抑制LPS誘導(dǎo)鼻黏膜炎癥，顯著抑制LPS誘導(dǎo)后鼻黏膜上皮細(xì)胞的HMGB1蛋白表達(dá)，提示