MTRR表達(dá)與生物功能對卵巢癌多藥耐藥影響的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分進(jìn)行論述：
　　第一章 葉酸代謝酶類的表達(dá)與生物功能對卵巢惡性腫瘤多藥耐藥影響的研究進(jìn)展（綜述）
　　卵巢惡性腫瘤嚴(yán)重威脅婦女生命和健康，其發(fā)病率在婦科惡性腫瘤中居第三位，僅次于宮頸癌，宮體癌，而其死亡率居首位。卵巢癌發(fā)病隱匿，很多患者在出現(xiàn)癥狀之前已有腹腔轉(zhuǎn)移，確診時60％-70％患者已屬于晚期。目前公認(rèn)的最佳治療方法以手術(shù)為主，輔以鉑類和紫杉醇聯(lián)合化療（一線化療），配合放療、生物學(xué)治療等，但至少有6

2、0％的患者最終出現(xiàn)獲得性耐藥，晚期患者五年生存率僅為30％-40％。卵巢癌多藥耐藥極大地影響了卵巢癌患者對化療的敏感性，是限制其臨床療效的主要原因。
　　FOLR1、MTRR和DHFR等是葉酸代謝通路中重要的酶，其活性的變化影響葉酸的正常代謝、脫氧核苷酸三磷酸鹽的生物合成以及DNA甲基化反應(yīng)，進(jìn)而在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展扮演重要角色。FOLR1是具有高親和力的葉酸受體，其位于細(xì)胞膜介導(dǎo)葉酸的胞吞途徑，有研究表明，F(xiàn)OLR1上皮來源的惡性

3、組織中表達(dá)明顯增高，抑制FOLR1，細(xì)胞的化療敏感性得到增加;MTRR能維持甲硫氨酸合成酶的活性，在MTR活化過程中發(fā)揮重要作用，影響Hcy代謝和DNA甲基化。目前國內(nèi)外有許多調(diào)查研究了葉酸代謝酶與腫瘤之間的關(guān)系，但研究成果之間仍存在不少爭議。葉酸代謝酶作為一個極富前景的研究方向，其與卵巢癌發(fā)生發(fā)展、多藥耐藥之間的關(guān)系尚很不明確，值得我們進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)。
　　第二章 FOLR1、MTRR和DHFR的表達(dá)對卵巢惡性腫瘤多藥耐藥中的臨

4、床意義
　　目的:研究卵巢惡性腫瘤組織中葉酸結(jié)合蛋白(FOLR1)、甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)、二氫葉酸還原酶(DHFR)的表達(dá)及其臨床意義。
　　方法:采用Western Blot檢測30例正常卵巢組織、50例卵巢良性腫瘤組織及80例卵巢惡性腫瘤組織中的FOLR1、MTRR蛋白表達(dá)情況;應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測相同標(biāo)本中DHFR基因的表達(dá)情況，分析其與惡性卵巢腫瘤間的臨床病理及多藥耐藥的相關(guān)性。
　　結(jié)果:(

5、1) FOLR1、MTRR在正常卵巢組織，卵巢良性腫瘤和卵巢惡性腫瘤中的表達(dá)量依次增高(P＜0.05);DHFR在正常卵巢組織，卵巢良性腫瘤和卵巢惡性腫瘤中的表達(dá)量依次降低(P＜0.05)。(2) FOLR1、MTRR在卵巢惡性腫瘤FIGO臨床分期中Ⅰ～Ⅱ期的表達(dá)量低于Ⅲ～Ⅴ期，在組織分級高分化中的表達(dá)量低于中低分化(P＜0.05);DHFR在FIGO臨床分期和組織分級表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。(3) FOLR1在鉑類藥物耐

6、藥型卵巢惡性腫瘤中的表達(dá)量低于鉑類藥物敏感型(P＜0.05);MTRR、DHFR在鉑類藥物耐藥型卵巢惡性腫瘤中的表達(dá)量高于鉑類藥物敏感型(P＜0.05);FOLR1在治療后仍進(jìn)展腫瘤中的表達(dá)量低于緩解者(P＜0.05);MTRR、DHFR在治療后仍進(jìn)展腫瘤中的表達(dá)量高于緩解者(P＜0.05)。(4) FOLR1在粘液性腫瘤中的表達(dá)量低于漿液性腫瘤(P＜0.05)，在有淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的卵巢惡性腫瘤中高于未有轉(zhuǎn)移者(P＜0.05)，與

7、患者的不同腫瘤病理分類、是否有大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移和腹水量多少無明顯相關(guān)(P＞0.05);MTRR在漿液性腫瘤中的表達(dá)量高于粘液性腫瘤(P＜0.05)，在有遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的卵巢惡性腫瘤中高于未轉(zhuǎn)移者(P＜0.05)，與患者是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否有大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移和腹水量無明顯相關(guān)(P＞0.05);DHFR在漿液性腫瘤中的表達(dá)量高于粘液性腫瘤和內(nèi)膜樣腫瘤(P＜0.05)，在有大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移的卵巢惡性腫瘤中低于未轉(zhuǎn)移者(P＜0.05)，與患者是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否有

8、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腹水量無明顯相關(guān)(P＞0.05)。(5)取FOLR1表達(dá)量界值為3.115時來判斷卵巢腫瘤性質(zhì)，ROC曲線的Youden指數(shù)最大，卵巢惡性腫瘤FOLR1表達(dá)量的高低與中位生存時間差別無明顯相關(guān)(P＞0.05)， COX模型多因素分析顯示FOLR1表達(dá)量不是影響患者生存預(yù)后的獨立因素;取MTRR表達(dá)量界值為0.618時來判斷卵巢腫瘤性質(zhì)，ROC曲線的Youden指數(shù)最大，卵巢惡性腫瘤MTRR表達(dá)量的高低與中位生存時間差別無明顯相

9、關(guān)(P＞0.05)， COX模型多因素分析顯示MTRR表達(dá)量不是影響患者生存預(yù)后的獨立因素;取DHFR表達(dá)量界值為0.331時來判斷卵巢腫瘤性質(zhì)，ROC曲線的Youden指數(shù)最大，卵巢惡性腫瘤DHFR表達(dá)量的高低與中位生存時間差別有相關(guān)性(P＜0.05)，COX模型多，因素分析顯示DHFR表達(dá)量是影響患者生存預(yù)后的獨立因素。
　　結(jié)論:FOLR1在卵巢惡性腫瘤組織中的表達(dá)量高于正常卵巢和卵巢良性腫瘤，在鉑類藥物敏感型卵巢惡性腫瘤中

10、FOLR1表達(dá)高于鉑類藥物耐藥型卵巢惡性腫瘤，提示FOLR1與卵巢惡性腫瘤多藥耐藥相關(guān);MTRR在惡性卵巢腫瘤組織中的表達(dá)量高于正常卵巢和良性卵巢腫瘤，MTRR在鉑類藥物耐藥型卵巢惡性腫瘤中表達(dá)高于鉑類藥物敏感型;DHFR在卵巢惡性腫瘤中表達(dá)低于正常卵巢和卵巢良性腫瘤，DHFR在鉑類藥物耐藥型卵巢惡性腫瘤中呈高表達(dá)，敏感型卵巢惡性腫瘤中低表達(dá)。提示三種酶可作為新型診斷標(biāo)志物有助于早期檢測卵巢惡性腫瘤，且其與惡性卵巢腫瘤鉑類耐藥關(guān)系密切新

11、，對于判斷及預(yù)測惡性卵巢腫瘤多藥耐藥的發(fā)生發(fā)展有重要意義。
　　第三章 MTRR基因?qū)β殉采掀ば园㏒KOV3耐順鉑細(xì)胞的體內(nèi)外生物功能研究
　　目的:構(gòu)建下調(diào)甲硫氨酸和酶還原酶(MTRR)的慢病毒載體并進(jìn)行鑒定。研究卵巢癌SKOV3/DDP細(xì)胞中MTRR基因表達(dá)下調(diào)后對其生物學(xué)功能的影響以及作用途徑。
　　方法:篩選干擾效果最好的shRNA，鏈接至pSicoR載體質(zhì)粒，重組陽性克隆進(jìn)行測序鑒定，重組質(zhì)粒與其輔助質(zhì)粒共同

12、轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝病毒，病毒顆粒感染SKOV3/DDP細(xì)胞，流式分選，RT-PCR和Western Blot檢測MTRR的表達(dá)。MTT法測定三組細(xì)胞(SKOV3/DDP、shNC-SKOV3/DDP、shMTRR-SKOV3/DDP)的生長增值情況、順鉑對三組細(xì)胞的IC50和不同順鉑濃度分別作用不同時間三組細(xì)胞的生長曲線、克隆形成;流式細(xì)胞術(shù)檢測不同順鉑濃度作用48小后時對三組細(xì)胞周期分布的影響。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了MTRR慢

13、病毒干擾載體，能高效感染SKOV3/DDP細(xì)胞，轉(zhuǎn)然后MTRR基因穩(wěn)定下調(diào)。實驗組細(xì)胞（shMTRR-SKOV3/DDP）與兩組對照組相比較:(1)順鉑對其作用的IC50值降低、增殖速度明顯降低。(2)順鉑對其生長抑制率增加(P＜0.05)，MTRR干擾后SKOV3/DDP對順鉑的敏感性增加。(3)順鉑誘導(dǎo)后細(xì)胞阻滯于G0/G1期，其比例明顯增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論:MTRR基因下調(diào)后能降低卵巢癌SKOV3/DDP細(xì)胞的增

14、殖能力; SKOV3/DDP細(xì)胞中MTRR基因下調(diào)后細(xì)胞對順鉑的敏感性增加;MTRR基因下調(diào)后順鉑將其細(xì)胞阻滯在G0/G1期。
　　第四章 MTRR基因?qū)β殉采掀ば园㏒K0V3細(xì)胞多藥耐藥中的自噬和凋亡的影響及機(jī)制研究
　　目的:探索MTRR基因下調(diào)后在順鉑耐藥的卵巢癌SKOV3細(xì)胞中凋亡和自噬的變化，以及對凋亡Caspase和Bcl-2家族以及PI3K-AKT1自噬通路的影響，為MTRR逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥提供可能的途徑，為臨床

15、使用提供有利數(shù)據(jù)。
　　方法:流式細(xì)胞術(shù)檢測不同順鉑濃度分別作用48小時誘導(dǎo)三組細(xì)胞的凋亡率;激光共聚焦檢測不同順鉑濃度作用48小后時對三組細(xì)胞LC3B分布的影響;Western Blot檢測一定順鉑濃度作用48小后時對三組細(xì)胞LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、p62的影響;雷帕霉素在實驗組細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬，檢測順鉑作用后生存率和凋亡率改變;透射電鏡觀察三組細(xì)胞自噬體。一定濃度的順鉑（4μg/ml）對三組細(xì)胞(SKOV3/DDP、shNC

16、-SKOV3/DDP、shMTRR-SKOV3/DDP)進(jìn)行不同時間誘導(dǎo)，并用使用免疫蛋白印跡(Westernblot)方法檢測caspase和Bcl-2家族以及PI3K-AKT1自噬通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和變化，得到蛋白表達(dá)發(fā)生變化的作用時間。再用一定濃度的順鉑對三組細(xì)胞作用一定時間，Western blot檢測關(guān)鍵蛋白，得出三組細(xì)胞間蛋白表達(dá)差異。
　　結(jié)果:順鉑誘導(dǎo)后，激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞LC3B-Ⅱ，聚集減少;順鉑誘導(dǎo)后

17、，Western Blot顯示細(xì)胞LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值降低，p62升高;雷帕霉素誘導(dǎo)實驗組細(xì)胞后，細(xì)胞在順鉑中的生存率升高，凋亡率降低;透射電鏡未見自噬體形成。三組細(xì)胞順鉑4μg/ml誘導(dǎo)三組細(xì)胞48小時后，實驗組細(xì)胞(shMTRR-SKOV3/DDP)與兩組對照組相比較:(1)凋亡通路上Bax，cleaved caspase-9，cleaved caspase-3以及cleaved PARP顯著升高(P＜0.05)，Bcl-

18、2顯著降低(P＜0.05)。(2)自噬通路上p-AKT1和p-mTOR顯著上調(diào)(P＜0.05)，而AKT1和mTOR無顯著變化。
　　結(jié)論:在順鉑誘導(dǎo)下凋亡增加;MTRR基因下調(diào)能在SKOV3/DDP細(xì)胞中減弱順鉑誘導(dǎo)產(chǎn)生的自噬。MTRR下調(diào)通過影響激活caspase和Bcl-2凋亡家族以及抑制PI3K-AKT1自噬通路可增加順鉑耐藥細(xì)胞的敏感性，也我們進(jìn)一步研究卵巢癌耐藥發(fā)展過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制研究及其在臨床中的應(yīng)用提供了重