齊墩果酸通過miR-122-CyclinG1-MEF2D對肺癌細(xì)胞增殖影響的研究.pdf

1、目的:
　　齊墩果酸(OA)是一種從植物中提取的化合物，具有抗腫瘤活性。然而，OA對細(xì)胞周期抑制作用的機(jī)制還沒有完全研究清楚。本研究設(shè)計通過幾種肺癌細(xì)胞探討OA引起與細(xì)胞周期相互作用的分子機(jī)制。CCNG1和MEF2D，兩者是被公認(rèn)的miR-122作用靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在OA作用后表達(dá)下調(diào)。維持CCNG1和MEF2D蛋白的正常表達(dá)可以抑制OA對肺癌細(xì)胞抗癌效應(yīng)。本研究主要證實在肺癌細(xì)胞中OA能刺激miR-122轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子表達(dá)，驗證在肺癌細(xì)

2、胞中OA所致的細(xì)胞周期阻滯是通過miR-122/CyclinG1/MEF2D途徑，有助于闡釋齊墩果酸抗腫瘤活性的分子機(jī)制。
　　方法:
　　(1)MTT法檢測OA處理肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、NCI-H460、NCI-H1299以及肺癌原始細(xì)胞（Primary LC1和Primary LC1）的時間依賴增值率和劑量依賴增值率;
　　(2)Quantitative-PCR檢測不同劑量和不同時間的OA處理的肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、N

3、CI-H460、NCI-H1299、Primary LC1、Primary LC1和MRC-5細(xì)胞中miR-122的表達(dá)水平。
　　(3)通過使用miR-122阻斷劑，降低miR-122的表達(dá)水平觀察OA對肺癌細(xì)胞A549和Primary LC1的作用。
　　(4)為進(jìn)一步探討OA通過miR-122抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，通過WesternBlot法檢測OA處理過的肺癌細(xì)胞中CCNG1和MEF2D蛋白的表達(dá)水平。
　　

4、(5)通過轉(zhuǎn)染pcDNA3-CCNG1+pcDNAMEF2D至A549、Primary LC1細(xì)胞，觀察OA對CCNG1和MEF2D蛋白的表達(dá)的影響。
　　(6)為進(jìn)一步探討OA是否增加miR-122的表達(dá)水平。Western Blot法檢測不同時間段和不同劑量的OA處理過的A549細(xì)胞中HNF1α、HNF3β、HNF4α和HNF6蛋白的表達(dá)水平。
　　(7)通過癌細(xì)胞種植建立小鼠肺癌模型，通過不同劑量的OA處理種植小鼠，觀

5、察腫瘤細(xì)胞生長的體積，Quantitative-PCR法檢測瘤體中miR-122的表達(dá)水平，Western Blot法檢測瘤體中CCNG1和MEF2D蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1. A549、NCI-H460、NCI-H1299、NCI-H1299、Primary LC1、Primary LC1和MRC-5經(jīng)過48h的培養(yǎng)，經(jīng)過0ug/ ml、15ug/ ml、30ug/ ml、60ug/ ml劑量的OA處理，我們發(fā)

6、現(xiàn)隨著劑量的增加，出現(xiàn)細(xì)胞分化率的下降(A549，10.7-39％，NCI-H460,1.3-41.8％; NCI-H1299,2-50.4％; Primary LC11,4.5-64.3; PrimaryLC2，1.8-46.9％)，但是在MRC-5細(xì)胞系中沒有明顯改變。同時我們還發(fā)現(xiàn)經(jīng)30ug/ml濃度的OA處理的細(xì)胞系，以時間依賴性抑制細(xì)胞生長，同時發(fā)現(xiàn)OA加入肺成纖維細(xì)胞系MRC-5中，增值速率沒有明顯的減少。
　　2.

7、Quantitative-PCR檢測A549、NCI-H460、NCI-H1299、NCI-H1299、PrimaryLC1和Primary LC1經(jīng)過48h的培養(yǎng)，經(jīng)過0ug/ml、15ug/ml、30ug/ml、60ug/ml劑量的OA處理。與con組相比，細(xì)胞miR-122的表達(dá)水平在15ug/ml組時沒有明顯的變化，在30ug/ ml組時有明顯變化（P＜0.05），在60ug/ ml組時有顯著變化（P＜0.01）。同時我們還發(fā)現(xiàn)

8、經(jīng)30ug/ml的OA處理的細(xì)胞系，與con組相比，細(xì)胞miR-122的表達(dá)水平在24h組時沒有明顯的變化，在48h組時有明顯變化(P＜0.05)，在72h組時有顯著變化(P＜0.01)。
　　3. 通過使用miR-122阻斷劑Antagomir，降低miR-122的表達(dá)水平，加入30ug/ml OA對A549和Primary LC1細(xì)胞的作用。研究結(jié)果顯示:與Antagomir/OA（-/-）組相比，（-/+）組中miR-122

9、的表達(dá)水平顯著增高（P＜0.01），細(xì)胞增殖率明顯下降(P＜0.05)，其中（+/-）組和(+/+)組沒有明顯變化。
　　4. 為進(jìn)一步探討OA通過miR-122抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，經(jīng)過0ug/ ml、15ug/ml、30ug/ml、60ug/ml劑量的OA處理A549和Primary LC1細(xì)胞Western Blot結(jié)果顯示:與0ug/ml劑量組相比，細(xì)胞中CCNG1蛋白的表達(dá)水平在15ug/ml組時明顯的降低(P＜0.0

10、5)，在30ug/ml組和60ug/ml組時有顯著變化（P＜0.01）。與0ug/ml劑量組相比，細(xì)胞中MEF2D蛋白的表達(dá)水平在15ug/ ml、30ug/ ml組和60ug/ml組時有顯著變化（P＜0.01）。經(jīng)過不同時間的30ug/ml劑量的OA處理A549和Primary LC1細(xì)胞Western Blot結(jié)果顯示:與0h組相比，細(xì)胞中CCNG1蛋白的表達(dá)水平在24h組時明顯的降低(P＜0.05)，在48h組和72hl組時有顯著

11、變化(P＜0.01)。與0h組相比，細(xì)胞中MEF2D蛋白的表達(dá)水平在24h組時明顯的降低(P＜0.05)，在48h組和72hl組時有顯著變化(P＜0.01)。
　　5. 通過轉(zhuǎn)染pcDNA3 CCNG1+pcDNAMEF2D至A549、Primary LC1細(xì)胞，經(jīng)30ug/ml劑量的OA處理。Western Blot結(jié)果顯示:與OA/pcDNA3-CCNG1+pcDNAMEF2D（-/-）組相比，（-/+）組和(+/+)組中CC

12、NG1和MEF2D蛋白的表達(dá)水平顯著增高（P＜0.01），（+/-）組中CCNG1和MEF2D蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。細(xì)胞增值率顯示:與OA/pcDNA3-CCNG1+pcDNAMEF2D（-/-）組相比，（-/+）組細(xì)胞增值率明顯降低（P＜0.05），（+/-）組和(+/+)組沒有明顯變化。
　　6. Western Blot法檢測經(jīng)過0ug/ ml、15ug/ ml、30ug/ ml、60ug/ ml劑量的OA

13、處理A549細(xì)胞48h培養(yǎng)，Western Blot結(jié)果顯示:與0ug/ml劑量組相比，細(xì)胞中HNF1α、HNF3β、HNF4α蛋白的表達(dá)水平在15ug/ml沒有明顯的改變，其中HNF6蛋白有明顯增加（P＜0.05）;在30ug/ml組和60ug/ml組時有顯著的增加（P＜0.01）。經(jīng)過30ug/ml劑量的OA處理培養(yǎng)0h、24h、48h和72h的A549細(xì)胞Western Blot結(jié)果顯示:與0h組相比，細(xì)胞中HNF1α、HNF3β

14、、HNF4α蛋白的表達(dá)水平在24h沒有明顯的改變，但是HNF6蛋白有明顯增加（P＜0.05）;在48h組和72h組中HNF1α、HNF3β、HNF4α和HNF6蛋白的表達(dá)水平有顯著的增加（P＜0.01）。
　　7. 通過體內(nèi)試驗，通過低劑量(40mg/kg)和高劑量(120mg/kg)的OA處理種植小鼠。腫瘤細(xì)胞生長的體積顯示:與Con組相比，低劑量組腫瘤體積減少，高劑量組腫瘤體積明顯降低(P＜0.05); Quantitativ

15、e-PCR結(jié)果顯示:與Con組相比，低劑量組瘤體中miR-122的表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變，高劑量組中miR-122的表達(dá)水平顯著增高（P＜0.01）。Western Blot結(jié)果顯示:與Con組相比，低劑量組瘤體中CCNG1蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，高劑量組瘤體中CCNG1蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）;低劑量組瘤體中MEF2D蛋白表達(dá)沒有明顯改變，高劑量組瘤體中CCNG1蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）;
　　結(jié)論: