CyclinG2抑制細(xì)胞增殖的實驗研究.pdf

1、中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文CyclinG2抑制細(xì)胞增殖的實驗研究姓名：田玉樓申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：細(xì)胞生物學(xué)指導(dǎo)教師：張學(xué)2002.4.1般而言，周期蛋白是細(xì)胞周期的正調(diào)節(jié)因子，促進(jìn)細(xì)胞增殖。目前，eycKnG2的功能及調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。根據(jù)現(xiàn)有研究資料分析，cyclinG2司能不同于典型的對細(xì)胞增殖起正調(diào)節(jié)作用的周期蛋自，屙可能對細(xì)胞周期起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，抑制細(xì)胞增殖。為了驗證這一假設(shè)l『本研究首先應(yīng)用RT—PCR方法克隆了cyclin

2、G2基因eDNA，并構(gòu)建了真核表達(dá)載體，進(jìn)一步應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，以體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系HeLa細(xì)胞和正常細(xì)胞系CV一1細(xì)胞作為受體細(xì)胞，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)的研究，觀察并研究cyclinG2高表達(dá)對細(xì)胞體外增殖的影響，并應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)對其調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行了初步探討。(首先，根據(jù)美國NCBIGenBank中已知cyclinG2基因eDNA序列設(shè)計引物：以人口腔癌前上皮細(xì)胞系POFA總RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)產(chǎn)物為模板，應(yīng)用PCR方法

3、擴(kuò)增得到了1070bp的特異片段，經(jīng)純化、酶切、連接到載體pcDNAB的BamHI和XbaI酶切位點上，轉(zhuǎn)化EColiJMl09感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR及酶切鑒定重組陽性克隆，并進(jìn)行核苷酸序列分析，證實所得eyclinG2克隆eDNA順序和開放閱讀框架(OpenReadingFrame，ORF)都正確。為了確保eyclinG2基因與載體的選擇性標(biāo)記基因neo能在受體細(xì)胞內(nèi)從單一轉(zhuǎn)錄本翻譯表達(dá)，我們又進(jìn)一步將cyclinG2eDNA亞克隆至

4、含內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(InternalRibosomeEnⅡySite，IRES)的質(zhì)粒plRESneo的BamHI和BstXI酶切位點上，構(gòu)建了真核表達(dá)載體pIRES—G2。pIKES—G2中cyclinG2的順序再次經(jīng)核苷酸序列分析確認(rèn)。在本文中，我們將cy—clinG2eDNA克隆到雙順反子真核表達(dá)載體plRESneo后進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染實驗，可確保G418篩選后的生存細(xì)胞均表達(dá)目的基因。載體plKESneo帶有腦心肌炎病毒的IRES順

5、序，IRES將插入的目的基因eyelinG2與載體本身的選擇性標(biāo)記基因neo兩個0RF隔開，使plRES—G2重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)僅產(chǎn)生單一轉(zhuǎn)錄本，兩種蛋白質(zhì)同時翻譯表達(dá)。plRESnoo的應(yīng)用克服了應(yīng)用peDNA3等真核表達(dá)載體時目的基因與載體本身的篩選標(biāo)記基因由于分別獨立轉(zhuǎn)錄和翻譯而不一定同時表達(dá)的缺點。繼之，以人宮頸癌細(xì)胞系HeLa及非洲綠猴腎細(xì)胞系CV一1為受體細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染實驗。應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pIPES—G2分別轉(zhuǎn)染至H