鯉魚蛋白酶體激活因子PA28-β亞單位基因克隆、鑒定及時(shí)空轉(zhuǎn)錄分析.pdf

1、PA28-α和PA28-β可被IFN-γ誘導(dǎo)，可以激活20S蛋白酶體前體，使之產(chǎn)生抗原肽被MHC Ⅰ類分子識(shí)別呈遞給細(xì)胞毒性T細(xì)胞，因此在MHC Ⅰ類抗原呈遞中具有重要作用。編碼PA28-α和PA28-β的基因PMSE1和PMSE2已在哺乳動(dòng)物中被很好的鑒定和闡述，而在魚類方面報(bào)道很少。本研究以熒光mRNA差異顯示技術(shù)獲得的含有鯉魚PA28-β亞單位cDNA3′端部分片段為核酸探針，地高辛標(biāo)記后，應(yīng)用核酸雜交法篩選有絲分裂原刺激的鯉魚外

2、周血白細(xì)胞cDNA文庫(kù)。此外，本研究根據(jù)PA28-β亞單位cDNA設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用半定量。RT-PCR方法，分析了在分離培養(yǎng)的正常白細(xì)胞和絲列原刺激的白細(xì)胞中該亞單位基因不同時(shí)間的轉(zhuǎn)錄差異情況，還對(duì)PA28-β在正常鯉魚和嗜水氣單胞菌Ahes01刺激后鯉魚的組織轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示：我們獲得的鯉魚PA28-β亞單位cDNA克隆全長(zhǎng)1175bp，GenBank獲得注冊(cè)號(hào)為EU255233，含有5′非翻譯區(qū)和3′非翻譯區(qū)及3′poly

3、(A)加尾信號(hào)(AATAAA)和poly(A)尾巴，中間是732bp大小編碼244個(gè)氨基酸的開放閱讀框。推測(cè)的蛋白序列與斑馬魚、石首魚、比目魚、河豚、短尾猊、狗、獼猴、牛、人和非洲蟾蜍的PA28-β同源性分別為95％、78％、73％、70％、65％、63％、63％、63％、63％和55％，在相同的進(jìn)化距離下比較哺乳動(dòng)物和魚類，人、猩猩、豬、狗等哺乳動(dòng)物保守序列比例約占70％，而魚類則相對(duì)較低，與哺乳動(dòng)物比較約只有30％保守，說(shuō)明魚類的分

4、子進(jìn)化要比哺乳動(dòng)物快，鯉魚與石首魚、比目魚、河豚相比，和斑馬魚的親緣關(guān)系更大，這可能是鯉魚和斑馬魚同屬淡水魚而石首魚、比目魚和河豚屬于海水魚的原因了。蛋白質(zhì)序列比對(duì)顯示鯉魚PA28-β蛋白序列中同樣含有KEKE基序、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜保留信號(hào)KPSM、典型的富含脯氨酸基序、可能的蛋白激酶C識(shí)別位點(diǎn)、高度保守的激活環(huán)和高度同源的C末端區(qū)域5個(gè)哺乳動(dòng)物中存在的保守功能區(qū)域：時(shí)間轉(zhuǎn)錄分析顯示：絲裂原刺激白細(xì)胞中PA28-β轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，尤其是ConA刺激后