BMSCs-Exosomal miRNA-214對氧化應激狀態(tài)下c-kit+CSCs凋亡及鈣穩(wěn)態(tài)的影響及機制探討.pdf

1、目的：干細胞移植治療已成為治療心肌梗死前景最佳的治療策略，其中內源性c-kit+心臟干細胞（c-kitpos Cardiac Stem Cells, c-kit+CSCs）具有心臟遺傳背景，可能是適用于心臟再生的最佳種子細胞。然而，在氧化應激微環(huán)境中，移植的干細胞定植、存活能力欠佳，無法有效發(fā)揮再生修復作用。那么促進移植干細胞或提高內源性干細胞存活能力促使其發(fā)揮生物學功能顯得尤為重要。研究提示骨髓間充質干細胞源Exosomes（Exos

2、omes derived from bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs-Exosomes）可通過向受體細胞傳遞非編碼RNA、蛋白、轉錄因子等促進多種組織、細胞再生修復進程。miRNA-214及其靶基因—鈣/鈣調素依賴蛋白激酶2D（Calcium/calmodulin dependent protein kinase II delta，CaMK2d）在既往研究中證實可調控多種細胞凋亡、增殖、

3、分化等。但在氧化應激等特定病理條件下BMSCs-Exosomal miRNA-214表達量發(fā)生怎樣的變化，以及BMSCs-Exosomes預處理c-kit+CSCs是否通過傳遞miRNA-214調控CaMK2d進而提高氧化應激狀態(tài)下細胞存活能力及鈣穩(wěn)態(tài)調節(jié)效應呢？這些問題目前尚無研究報道。
　　方法：⑴采用酶消化法聯(lián)合間標免疫磁珠分選法分選、培養(yǎng)SD大鼠c-kit+CSCs，并對CSCs表型進行鑒定；通過不同濃度H2O2干預c-k

4、it+CSCs模擬氧化應激微環(huán)境，隨后采用流式細胞技術檢測各組細胞凋亡及死亡情況，摸索誘導c-kit+CSCs氧化應激細胞模型的適宜濃度。⑵采用全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)SD大鼠BMSCs，并對BMSCs表型及純度進行分析，取第三代至第五代BMSCs（P3-P5 BMSCs），為后續(xù)實驗做準備；通過不同濃度H2O2干預BMSCs以模擬與c-kit+CSCs處于同樣病理條件，采用CCK-8法檢測細胞活性。⑶采用差速超速離心法，提取P3-P5 BMS

5、Cs條件培養(yǎng)基中的Exosomes，并采用透射電子顯微鏡、納米顆粒跟蹤分析技術及Western Blotting對Exosomes進行鑒定；再通過DiI染劑著色Exosomes，熒光顯微鏡下觀察CSCs攝取Exosomes情況；采用CCK-8法，摸索BMSCs-Exosomes工作濃度，為后續(xù)實驗做準備。⑷為驗證Exosomes能否在旁分泌效應中發(fā)揮作用，我們設計以下實驗分組：正常組（Normal Groups，Nor）：未予以任何處理

6、的c-kit+CSCs；對照組（Control Groups， Ctrl）：100μM H2O2處理的c-kit+CSCs誘導細胞凋亡；正常狀態(tài)下去除BMSCs Exosomes的條件培養(yǎng)基處理組（Exosomes-Free conditioned medium Groups, Exo-F）：c-kit+CSCs與去除Exosomes的BMSCs條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)24h后予以100μM H2O2處理2h；正常狀態(tài)下BMSCs所分泌的Exo

7、somes處理組（Normal Exosomes Groups, Exo-N）：c-kit+CSCs與正常狀態(tài)下BMSCs所分泌的Exosomes共培養(yǎng)24h后予以100μM H2O2處理2h。采用流式細胞術檢測各組c-kit+CSCs的凋亡率；采用Western Blotting檢測各組中凋亡相關蛋白Cleaved CASP3、CASP3蛋白表達情況。⑸為進一步探討H2O2對Exosomes效應的影響，能否發(fā)揮更佳的細胞保護效應，將實

8、驗分為4組：Nor、Ctrl、Exo-N、氧化應激環(huán)境下BMSCs分泌的Exosomes處理組（Exosomes derived from BMSCs pretreated with H2O2,Exo-H）：100μM H2O2預處理 BMSCs2h后提取Exosomes，將其與c-kit+CSCs共培養(yǎng)24h后同樣予以100μM H2O2處理c-kit+CSCs2h。采用流式細胞術檢測各組c-kit+CSCs的凋亡情況；采用Weste

9、rn Blotting檢測各組中凋亡相關蛋白Cleaved CASP-3、CASP-3蛋白表達情況。⑹為對Exosomes調節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)、抗凋亡的潛在機制進行探討，我們通過miRNAs調節(jié)心臟譜系細胞凋亡、細胞鈣穩(wěn)態(tài)等研究進展及ExoCarta數(shù)據(jù)庫初篩出候選Exosomal miRNAs；通過RT-PCR對預測結果進行初步驗證，我們先檢測正常及氧化應激環(huán)境中Exosomal miRNA-214表達情況，明確miRNA-214是否存在于BM

10、SCs-Exosomes中，且病理生理條件下Exosomal miRNA-214是否發(fā)生差異性表達；隨后檢測第一部分中Nor組、Ctrl組、Exo-N組、Exo-H組中miRNA-214表達情況，明確經不同條件處理后c-kit+CSCs中miRNA-214是否發(fā)生變化情況。⑺為驗證miRNA-214是否參與抗CSCs凋亡效應，實驗分為6組：Nor組：未予以任何處理的CSCs；Ctrl組：100μM H2O2處理CSCs2h；CSCs-M

11、組：CSCs轉染miRNA-214 Mimics48h；CSCs-I組：CSCs轉染miRNA-214 Inhibitors48h；CSCs-M+H2O2組：CSCs轉染miRNA-214 Mimics48h并予以100μM H2O2處理2h；CSCs-I+H2O2組：CSCs轉染miRNA-214 Inhibitors48h并予以100μM H2O2處理2h。流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況。⑻為驗證BMCS-Exosomal miRN

12、A-214是否參與抗凋亡進程？首先在BMSCs水平過表達或抑制miRNA-214并采用RT-PCR檢測在氧化應激情況下各組miRNA-214表達情況，同時提取其Exosomes，同樣采用RT-PCR檢測miRNA-214表達。隨后將實驗分為8組：Nor組：未予以任何處理的CSCs；Ctrl組：100μM H2O2處理CSCs2h；Exo-H組：100μM H2O2預處理的BMSCs后提取其Exosomes，并將其與CSCs共孵育24h，

13、隨后予以100μM H2O2處理CSCs2h；Exo-M組及Exo-I組：在BMSCs水平過表達或抑制miRNA-214后100μM H2O2預處理BMSCs并提取其Exosomes，并將其分別與CSCs共同孵育24h，隨后予以100μM H2O2處理CSCs2h；Exo-H+CSC-I組、Exo-M+CSC-I組及Exo-I+CSC-I組：即在Exo-H組、Exo-M組及Exo-I組水平上同時抑制CSCs中miRNA-214表達。RT

14、-PCR檢測各組miRNA-214表達、流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況。接著將實驗分為4組：Nor組，Ctrl組，Exo-H組， Exo-H+CSC-I組，進一步采用Western Blotting檢查凋亡相關蛋白CASP3及其剪切體形式表達變化，以及激光共聚焦顯微鏡檢測細胞內鈣離子變化。⑼為對Exosomal miRNA-214發(fā)揮抗凋亡及鈣穩(wěn)態(tài)調節(jié)作用進行進一步探討，我們先通過多個生物信息分析平臺綜合預測Exosomal miRNA

15、-214 Target Genes；再對預測結果進行初步驗證，實驗分為6組：Nor組（同上）、Ctrl組（同上）、Exo-H組（同上）、Exo-M組（同上）、Exo-I組（同上）、Exo-I+CSC-I組（同上）。以RT-PCR分別檢測各組細胞中miRNA-214及CaMK2d mRNA的表達量的變化；以Western Blotting分別檢測各組細胞中CaMK2d蛋白表達情況。⑽CaMK2d是否對Exosomal miRNA-214發(fā)

16、揮抗凋亡及鈣穩(wěn)態(tài)調節(jié)作用起至關作用？將實驗分為以下幾組：Ctrl組，Exo-H組，Exo-H+CaMK2d組：過表達CSCs中CaMK2d并予以Exo-H處理24h；Exo-I+CSC-I+siR-CaMK2d組：抑制CSCs中CaMK2d并經miRNA-214 Inhibitors轉染24h，隨后加入Exo-I共培養(yǎng)24h；建立氧化應激細胞模型。采用RT-PCR檢測各組細胞中miRNA-214及CaMK2d mRNA的相對表達量；采用

17、Western Blotting檢測各組中CaMK2d蛋白表達情況；采用流式細胞技術檢測各組CSCs凋亡情況，Western Blotting檢測細胞凋亡相關蛋白變化；采用激光共聚焦顯微鏡檢測細胞內鈣負荷情況。
　　結果：①體外分離培養(yǎng)原代SD大鼠CSCs，1周后見多角形或三角形的CSCs鋪滿培養(yǎng)瓶底；免疫磁珠分選后，細胞免疫熒光鑒定及流式細胞術鑒定CSCs表型，結果顯示， CSCs表面抗原c-kit表達量高達90％以上，而CD4

18、5及CD34呈陰性表達。流式細胞術結果提示，100μM H2O2處理2h時，c-kit+CSCs細胞早期凋亡率達到70.68%（P<0.05），而死亡率無明顯改變（P>0.05），故本實驗擬用100μM H2O2處理c-kit+CSCs2h以模擬氧化應激環(huán)境，建立氧化應激細胞模型。②通過全骨髓培養(yǎng)BMSCs，隨著細胞傳代，雜細胞逐漸減少，流式細胞術鑒定BMSCs表型，結果顯示CD29及CD90陽性表達，而不表達CD45；采用CCK8法檢

19、測與c-kit+CSCs同樣病理條件下BMSCs的活性，結果顯示，與0μM組相比，以100μM H2O2處理2h時，BMSCs活性達峰值（P<0.05）。③通過差速超速離心法分離出BMSCs條件培養(yǎng)基中Exosomes。透射電鏡下可見直徑約100nm囊泡結構，多呈類球形或茶托盤形，腔內可見低密度區(qū)；納米顆粒跟蹤分析技術（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）對Exosomes粒子直徑進行分析，可見粒子多集

20、中在111nm；經Western Blotting檢測，CD9、CD63、Alix蛋白為陽性表達；Exosomes-DiI紅色熒光點聚集于CSCs內；通過CCK-8法檢測在不同濃度Exosomes預處理后CSCs細胞活性，結果提示，隨Exosomes濃度增加CSCs活性增強，高濃度（400、800μg/ml）Exosomes干預后CSCs活性差異不明顯，故本實驗擬用400μg/ml處為后續(xù)Exosomes工作濃度。④通過不同條件處理CS

21、Cs后，采用流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況，結果顯示，與Nor組相比較，Ctrl組細胞凋亡率明顯升高；較之Ctrl組，Exo-N組及Exo-F組細胞凋亡率明顯下降，且Exo-N組細胞凋亡率低于Exo-F組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Western Blotting結果示，與Nor組相比較，H2O2預處理后Cleaved CASP3/CASP3比率明顯升高；而Exo-N組及Exo-F組Cleaved CASP3/CASP3比率

22、低于Ctrl組，但仍高于Nor組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。⑤驗證了H2O2能否增強Exosomes的抗細胞凋亡作用。流式細胞術結果提示，Exo-H組中細胞早期凋亡率及細胞晚期凋亡率皆低于Exo-N組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Western Blotting結果示，與Exo-N組相比，Exo-H組中Cleaved CASP3/CASP3比率明顯下降（P<0.05）。⑥通過miRNAs研究進展及ExoCarta數(shù)

23、據(jù)庫，我們初篩出miRNA-214作為候選Exosomal miRNAs。我們使用100μM H2O2處理BMSCs后提取BMSCs-Exosomes，檢測Exosomal miRNA-214表達情況，RT-PCR檢測結果顯示，較之未處理的BMSCs-Exosomes組，經H2O2處理后BMSCs-Exosomal miRNA-214明顯上升（P<0.05）；除此之外，為了解不同處理條件對CSCs中miRNA-214水平的影響， RT-

24、PCR檢測結果顯示，較之Ctrl組，Exo-N及Exo-H中miRNA-214顯著增高，且后者高于前者，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。⑦Exosomal miRNA-214是否參與抗凋亡進程。將實驗分為6組，結果顯示未加入H2O2時，CSCs-M組與CSCs-I組無明顯細胞凋亡，與Nor組相比無差異（P>0.05）,予以H2O2處理后，與Nor組相比，Ctrl組細胞凋亡明顯上升（P<0.05），與Ctrl相比，CSCs-M+H2O

25、2組細胞凋亡下降（P<0.05），CSCs-I+H2O2組凋亡上調（P<0.05）。緊接著BMSCs水平過表達或抑制miRNA-214，結果顯示，氧化應激情況下其釋放的Exosomes中miRNA-214相應表達上調或下調，提取的Exosomes用于后續(xù)試驗。隨后，我們將實驗分為8組，采用RT-PCR檢查各組miRNA-214表達，結果顯示，與Nor相比，Ctrl組中miRNA-214表達上調；內化Exosomes后，與Crtl相比，E

26、xo-H組及Exo-M組中miRNA-214表達上調，其中Exo-M組miRNA-214表達升高最顯著（P<0.05），而Exo-I組中miRNA-214表達與Ctrl組無明顯差異。同時抑制CSCs中miRNA-214表達后，與Ctrl相比，Exo-H+CSC-I組及Exo-M+CSC-I組中miRNA-214表達仍處于高水平（P<0.05），Exo-I+CSC-I組中miRNA-214表達明顯降低。流式細胞術檢查各組凋亡情況，可見與C

27、trl組相比，Exo-H組、Exo-M組及Exo-I組細胞凋亡明顯下降，其中Exo-M組下降最為顯著，Exo-H組次之（P<0.05）。同時在CSCs水平抑制miRNA-214表達后，可見與Ctrl相比，Exo-H+CSC-I組、Exo-M+CSC-I組中細胞凋亡仍降低（P<0.05），但較相應的Exo-H組、Exo-M組細胞凋亡增加（P<0.05）。而與Ctrl相比，Exo-I+CSC-I組中細胞凋亡無明顯差異（P>0.05）。⑧驗證

28、BMSCs-Exosomal miRNA-214參與細胞凋亡后，將實驗分為4組， Western Blotting結果提示，Ctrl組誘導細胞促凋亡蛋白Cleaved CASP3表達上調（P<0.05）；與Ctrl相比，Exo-H組中Cleaved CASP3表達下調（P<0.05），而Exo-H+CSC-I組中Cleaved CASP3表達無明顯變化（P>0.05）。那么BMSCs-Exosomal miRNA-214是否參與調控鈣穩(wěn)

29、態(tài)？結果顯示加入H2O2后CSCs內鈣離子熒光強度明顯上調；與H2O2處理組相比較，Exo-H處理組CSCs內鈣離子熒光強度明顯下降；而Exo-I+CSCs-I干預組中鈣離子熒光差值無明顯差異。⑨通過TargetScan數(shù)據(jù)庫、GCBI數(shù)據(jù)平臺及KEGG Pathway等生物信息分析平臺預測得miRNA-214可能通過作用于CaMK2d mRNA3’UTR參與BMSCs-Exosomes調節(jié)氧化應激狀態(tài)下細胞凋亡進程及鈣穩(wěn)態(tài)平衡。RT-

30、PCR結果提示，較之Ctrl組，Exo-H及Exo-M組中miRNA-214顯著增高，且后者明顯高于前者；而Exo-I及Exo-I+CSC-I組中miRNA-214明顯降低，且后者明顯低于前者；與Ctrl組相比較，其余五組中CaMK2d mRNA表達量無明顯差異(P>0.05)。Western Blotting結果提示，較之Ctrl組，Exo-H及Exo-M組中CaMK2d蛋白水平顯著降低，且Exo-M組降低趨勢更為顯著（P<0.05）

31、；而Exo-I及Exo-I+CSC-I組中CaMK2d蛋白水平明顯升高，且Exo-I+CSC-I組降低趨勢更為顯著（P<0.05）。⑩探討CaMK2d是否參與Exosomal miRNA-214抗凋亡進程，實驗分4組。RT-PCR結果提示，較之Ctrl組，Exo-H組與Exo-H+CaMK2d組中miRNA-214表達上調（P<0.05）；Exo-I+CSC-I+siRNA-CaMK2d組中miRNA-214較Ctrl組顯著下降，差異具

32、有統(tǒng)計學意義（P<0.05），較之Ctrl組，Exo-H組中CaMK2d mRNA表達無明顯變化，而Exo-H+CaMK2d組中CaMK2d表達上調（P<0.05）， Exo-I+CSC-I+siRNA-CaMK2d組中CaMK2d mRNA顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Exo-H干預之后，CSCs中CaMK2d蛋白水平明顯下調，而Exo-H+CaMK2d組中CaMK2d蛋白表達上調（P<0.05），Exo-I+CSC-

33、I+siRNA-CaMK2d組中CaMK2d蛋白表達顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義。流式細胞術結果示，與Ctrl組相比較， Exo-H+CaMK2d組中細胞凋亡較Exo-H組明顯增加（P<0.05）， Exo-I+CSC-I+siRNA-CaMK2d組中細胞凋亡下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞內鈣穩(wěn)態(tài)情況：與Ctrl組相比較，Exo-H處理組c-kit+CSCs內鈣離子熒光強度明顯下降；而Exo-H+C

34、aMK2d組鈣離子熒光差值明顯升高（P>0.05）。當抑制Exosomes及細胞中miRNA-214后，同時抑制CaMK2d表達，即Exo-I+CSC-I+siRNA-CaMK2d鈣離子熒光差值明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結論：⑴通過差速超速離心法成功分離出BMSCs條件培養(yǎng)基中Exosomes；⑵過氧化氫誘導BMSCs分泌功能變異的Exosomes可能通過調節(jié)氧化應激狀態(tài)下c-kit+CSCs細胞細胞凋亡進程；⑶H2O2