CpG-ODN與受體TLR9在酸性條件下特異性結合的研究.pdf

1、CpG-ODN是一些發(fā)現(xiàn)于細菌中含有未甲基化的CpG二核苷酸對并且具有免疫激活作用的寡核苷酸。大量研究已證明CpG-ODN具有直接激活B細胞增殖、促進樹突狀細胞成熟及誘導抗原呈遞細胞分泌多種細胞因子等作用。應用基礎方面的研究表明CpG-ODN可以作為一類新型的免疫佐劑在抗腫瘤、抗感染和防治哮喘等方面具有非常樂觀的應用前景。鑒于CpG-ODN廣泛的免疫調節(jié)作用及應用潛力，對其細胞內分子作用機制的研究成為當前的一個熱點，而焦點問題是尋找免疫

2、細胞上CpG-ODN的特異性識別受體并闡明其信號跨膜傳遞的機制。 最近的研究發(fā)現(xiàn)CpG-ODN的特異性識別受體極可能是Toll-Like-Receptors(TLRs)家族的新成員——TLR9，證據(jù)主要來自基因敲除小鼠，即如果將TLR9或TLR家族共用的下游信號分子的接頭分子——MyD88的基因敲除后，則基因敲除小鼠的免疫細胞就失去了對CpG-ODN刺激的應答性，而且TLR9是一種膜蛋白，其胞外部分含有與甲基化CpG-DNA結合

3、蛋白MBD-1-4同源的DNA結合域，這提示CpG-ODN系與TLR9結合之后再通過接頭分子MyD88向內傳遞激活信號。但令人困惑的是目前一直未能直接觀察到TLR9與CpG-ODN的特異性相互作用，而且免疫細胞膜上并不存在CpG-ODN的特異性結合位點。盡管ODN能與細胞膜結合，但這些結合均沒有CpG序列的特異性，而且證據(jù)表明免疫細胞對CpG-ODN的特異性識別及信號觸發(fā)不是發(fā)生于細胞外膜上，而是繼發(fā)于CpG-ODN被細胞內吞和內體酸化

4、之后。據(jù)此我們推測：如果TLR9的確是CpG-ODN的特異性受體，則TLR9與CpG-ODN的特異性結合及相關激活信號的觸發(fā)極有可能發(fā)生于CpG-ODN被內吞之后的酸性內體中，而不是發(fā)生于細胞外膜上。亦即TLR9與CpG-ODN的特異性結合極有可能需要一個特定的外在條件即偏酸性的pH環(huán)境。 為證實上述推測，我們在研究中比較了不同pH條件下CpG-ODN與細胞膜的結合及其免疫調節(jié)活性，發(fā)現(xiàn)：在中性pH條件下ODNs與免疫細胞膜的結

5、合的確沒有序列選擇性，但在偏酸性pH條件卻能觀察到CpG-ODN與免疫細胞膜有特異性結合，而且在微偏酸條件下，免疫細胞對CpG-ODN的刺激更加敏感。另外，我們以RT-PCR方法從小鼠脾細胞mRNA中擴增出TLR9基因，將胞外區(qū)亞克隆至pcDNA3.1真核表達載體，轉入COS7細胞瞬時表達，表達產物可被抗小鼠TLR9抗體特異性識別；以凝膠阻滯實驗檢測表達產物與ODNs在不同pH條件下的相互作用，發(fā)現(xiàn)偏酸條件下(pH6.4)表達產物與OD

6、Ns的結合較中性條件下明顯增強，而且與CpG-ODN的結合強于作為對照的非CpG序列ODN，說明重組表達的TLR9胞外區(qū)能以pH依賴方式與CpG-ODN特異性結合。上述實驗結果進一步支持我們的猜想，據(jù)此我們提出可能存在一種新的胞外刺激信號跨膜轉導方式，即CpG-ODN系與其受體TLR9一起內吞進入內體并酸化后方能發(fā)生CpG序列特異性的高親和力結合，進而啟動下游信號的轉導。這與傳統(tǒng)的胞外刺激分子與膜受體的結合及激活信號觸發(fā)均發(fā)生于細胞外膜