甲狀腺激素對(duì)氚致神經(jīng)元遷移障礙的改善作用.pdf

1、目的:本研究用氚水(HTO)和甲狀腺激素(thyroxineTH)按相應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件處理體外培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞,觀察其遷移距離的改變及遷移相關(guān)因子如β-tubulin微管蛋白、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)mRNA、ReelinmRNA和整合素α5β1表達(dá)的變化,探討甲狀腺激素對(duì)氚輻射所致大鼠海馬神經(jīng)元遷移障礙的改善作用。
　　方法:(1)神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)取新生1dSD大鼠,無(wú)菌條件下分離大鼠海馬神經(jīng)元,培養(yǎng)基為DMEM/F12(

2、含10％胎牛血清、2%B27、20μg/mLbFGF與20μg/mLEGF),置于37℃,5%CO2,飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);
　　(2)阿糖胞苷處理接種第3天加入終濃度為5μmol/LAra-c作用24h,抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖,純化神經(jīng)元;
　　(3)細(xì)胞分組Ara-c處理后,每3天更換培養(yǎng)液,按此方法培養(yǎng)的神經(jīng)元經(jīng)NF160免疫組化染色證實(shí)純度達(dá)90%以上。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為:①對(duì)照組,②HTO組,③TH組,④HTO+TH組

3、,7d后,②和④組加入終濃度為3.7×105Bq/ml的HTO,③和④加入終濃度為0.3ug/ml的TH,①加入等量的PBS做空白對(duì)照;
　　(4)細(xì)胞遷移距離測(cè)定用LeicaAF6000活細(xì)胞工作站分別觀察不同實(shí)驗(yàn)條件下神經(jīng)元細(xì)胞遷移的情況,觀察時(shí)間為8h,并用LAS-AF-Lite2.3.0軟件分析;
　　(5)Westernblot法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)微管蛋白和整合素α5β1的表達(dá)情況以ImageJ軟件進(jìn)行半定量分析,將測(cè)

4、出各條帶IOD值除以GAPDH的IOD值,得到一相對(duì)強(qiáng)度(relativeintensity,RI),通過(guò)各處理組RI值的比較可得出蛋白表達(dá)的變化規(guī)律。
　　(6)免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)微管蛋白和整合素α5β1的表達(dá)情況
　　(7)半定量RT-PCR法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)BDNF及ReelinmRNA的表達(dá)PCR產(chǎn)物在紫外透射儀上檢測(cè),凝膠成像分析系統(tǒng)上掃描分析。同時(shí)以GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。將測(cè)出各條帶IOD值除以GAPD

5、H的IOD值,得到一RI值,通過(guò)各處理組RI值的比較可得出mRNA表達(dá)的變化規(guī)律。
　　(8)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(`x±s),數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,各組之間進(jìn)行兩獨(dú)立樣本間t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:(1)倒置顯微鏡下觀察,培養(yǎng)7天神經(jīng)元細(xì)胞胞體較飽滿,立體感強(qiáng),折光性好、光暈明顯,細(xì)胞與細(xì)胞之間突起聯(lián)系緊密,胞體及突起表面平滑。
　　(2)遷移距離測(cè)定結(jié)果顯示:與

6、對(duì)照相比,受HTO照射神經(jīng)細(xì)胞遷移距離明顯縮短,TH處理過(guò)的兩組神經(jīng)細(xì)胞遷移距離均明顯延長(zhǎng),且同為受照細(xì)胞,TH處理過(guò)的神經(jīng)細(xì)胞遷移得更遠(yuǎn)。單純TH處理的神經(jīng)細(xì)胞遷移距離也比受照細(xì)胞遠(yuǎn)(P<0.01)。
　　(3)Westernblot及免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:與對(duì)照相比,TH處理過(guò)的兩組神經(jīng)細(xì)胞β-微管蛋白、整合素α5β1的RI值均明顯增大,且同為受照細(xì)胞,TH處理過(guò)的神經(jīng)細(xì)胞β-微管蛋白、整合素α5β1的RI值顯著增大,單純TH

7、處理的神經(jīng)細(xì)胞β-微管蛋白、整合素α5β1的RI值也比受照細(xì)胞大(P<0.01)。
　　(4)RT-PCR結(jié)果顯示:與對(duì)照相比,受HTO照射的神經(jīng)細(xì)胞BDNFmRNA、ReelinmRNA的RI值明顯減小,TH處理過(guò)的兩組神經(jīng)細(xì)胞BDNFmRNA、ReelinmRNA的RI值均明顯增大,且同為受照細(xì)胞,TH處理過(guò)的神經(jīng)細(xì)胞BDNFmRNA、ReelinmRNA的RI值顯著增大,單純TH處理的神經(jīng)細(xì)胞BDNFmRNA、Reelinm