miR-374a的發(fā)現(xiàn)及其靶基因在MERS-CoV感染致病過程中的作用探索.pdf

1、中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)是一種目前新發(fā)現(xiàn)的最大的RNA病毒，具有致病性強、致死率高的特點，其感染和傳播給人類帶來了新的挑戰(zhàn)。但是，目前關(guān)于MERS-CoV的致病通路的有關(guān)研究很少。microRNA（miRNA）作為一類新型的調(diào)控因子，在病毒致病過程中起到非常重要的作用。本課題從miRNA角度對MERS-CoV的致病通路進行了研究，有利于進一步闡明MERS-CoV與宿主之間的相互作用，并為發(fā)現(xiàn)抗MERS-CoV的藥物提供

2、新的靶點和策略。
　　研究目的:探索體內(nèi)重要調(diào)控分子miRNA在MERS-CoV致病過程中的作用及相關(guān)調(diào)控分子機制。
　　研究方法:
　　1.MERS-CoV感染后的致病通路探索:①MERS-CoV感染致病相關(guān)miRNA篩選:預(yù)測分析可能在MERS-CoV感染致病過程中具有重要作用的miRNA。通過MERS-CoV感染的細胞miRNA表達譜芯片的差異分析，選擇信號值有明顯變化的miRNA，利用MTT實驗篩選出可能在ME

3、RS-CoV感染致病過程中具有重要作用的miRNA，qPCR驗證MERS-CoV感染后該miRNA在胞內(nèi)的表達。②檢測miR-374a對細胞增殖的影響:將miR-374a mimics瞬時轉(zhuǎn)染入細胞，利用MTT實驗檢測 miR-374a的過表達對細胞增殖的影響。③預(yù)測分析miR-374a可能靶向的靶基因:通過MERS-CoV感染的細胞mRNA表達譜芯片的差異分析，綜合在線分析(Targetscan，pichtar)等方法預(yù)測miR-37

4、4a的靶基因，取預(yù)測交集，預(yù)測到miR-374a可能靶向BolA33'UTR，qPCR驗證分析的結(jié)果。④通過qPCR和Western blotting實驗方法檢測了miR-374a在mRNA和蛋白質(zhì)水平上對BolA3表達的影響。⑤miR-374a對BolA3的靶向性研究:構(gòu)建含有BolA33'UTR的報告基因載體，與miR-374a過表達載體共轉(zhuǎn)染入細胞，通過雙熒光素酶報告基因檢測miR-374a對BolA33'UTR的靶向性。

5、　　2.BolA3基因的克隆表達及特異性抗體制備:為了研究BolA3在細胞中的功能，需要進行細胞中BolA3蛋白表達檢測，因為沒有用于表達檢測合適的市售抗體，我們制備了BolA3的多克隆抗體。①基因克隆:從人肺癌細胞系A(chǔ)549細胞中提取總RNA，通過RT-PCR擴增出BolA3基因。②載體構(gòu)建:將克隆基因構(gòu)建入pQE30原核表達載體中。③蛋白誘導表達:在大腸桿菌中誘導蛋白表達，Western blotting方法鑒定帶有His標簽的重組

6、BolA3蛋白，分析蛋白表達形式。④蛋白純化:使用Ni柱親和層析法純化該蛋白。⑤抗體制備:程序免疫大耳白兔，耳緣靜脈采血分離免疫后兔血清，ELISA方法檢測血清中抗體滴度。⑥抗體鑒定:通過Western blotting方法，檢測制備的抗體與原核及真核表達的BolA3蛋白結(jié)合特異性。
　　3.BolA3在細胞中的定位分布及對ATP生成的研究:①蛋白在各細胞系中的表達:培養(yǎng)多種肺、肝、腎、腦等細胞系，裂解細胞，蛋白電泳，通過West

7、ern blotting方法利用制備的多克隆抗體檢測多種細胞系中BolA3的內(nèi)源性表達。②真核表達載體構(gòu)建:PCR擴增出BolA3基因片段，構(gòu)建入pMD18-T載體，雙酶切從pMD18-T上切下BolA3基因片段，構(gòu)建入相同酶切的pEGFP-C1載體中。③蛋白定位:構(gòu)建的EGFP-BolA3融合表達的真核表達載體，瞬時轉(zhuǎn)染入細胞內(nèi)，檢測到綠色熒光的表達。通過激光共聚焦實驗檢測綠色熒光的細胞與不同定位熒光標記的共定位情況，檢測BolA3的

8、細胞定位。④BolA3表達抑制對細胞功能的影響:建立BolA3抑制模型，篩選BolA3 RNAi的有效區(qū)域，構(gòu)建重組表達BolA3 RNAi腺病毒，感染細胞后定量PCR法和Westem-Blotting方法檢測細胞內(nèi)BolA3的表達抑制情況，MTT實驗檢測感染上述腺病毒抑制細胞內(nèi)BolA3表達后，對細胞增殖的影響。利用熒光法檢測抑制細胞內(nèi)BolA3表達對細胞ATP生成的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1.在中東呼吸綜合征冠狀病毒

9、(MERS-CoV)感染的細胞的表達芯片進行差異篩選中發(fā)現(xiàn):①MERS-CoV引起miRNA差異表達譜分析，篩選出7個信號值有明顯上升的miRNA，并從中篩選出1個可能在MERS-CoV感染致病中有重要作用的miRNA miR-374a，通過qPCR驗證了MERS-CoV能夠促進細胞內(nèi)miR-374a的表達;②功能實驗檢測證明miR-374a在細胞中過量表達可以抑制細胞的增殖;③在MERS-CoV影響miR-374a表達的研究中發(fā)現(xiàn)，m

10、iR-374a可能靶向調(diào)控BolA33'-UTR。分析該分子可能在MERS-CoV感染致病通路中起到重要作用;④qPCR方法對MERS-CoV在細胞中調(diào)控BolA3表達進行了鑒定，結(jié)果顯示MERS-CoV感染細胞后，能夠抑制細胞內(nèi)BolA3;⑤miR-374a靶向BolA3的鑒定:qPCR和Western blotting實驗驗證了miR-374a能夠在mRNA和蛋白質(zhì)水平上抑制BolA3的表達;熒光素酶檢測報告基因結(jié)果說明miR-37

11、4a能夠靶向抑制BolA33'UTR。
　　2.BolA3蛋白在細胞中的功能研究:①抗BolA3多克隆抗體制備和鑒定:轉(zhuǎn)化構(gòu)建的BolA3原核表達載體入M15感受態(tài)，誘導蛋白表達，利用純化獲得的蛋白程序免疫大耳白，獲得免疫后兔血清，Western blotting方法鑒定所制備抗體對原核及真核表達BolA3蛋白的結(jié)合具有高度特異性;②使用制備的抗體檢測到BolA3在人肺、神經(jīng)、肝和腎細胞系中均有內(nèi)源性表達，提示其在機體的功能廣泛;

12、③將成功構(gòu)建的EGFP-BolA3融合表達的真核表達載體pEGFP-C1-BolA3瞬時轉(zhuǎn)染入細胞，激光共聚焦實驗，檢測到BolA3蛋白與線粒體標記物共定位于線粒體和細胞核;④建立BolA3抑制模型，制備重組表達BolA3 RNAi腺病毒，感染細胞，檢測其可以有效抑制細胞內(nèi)BolA3的表達。使用腺病毒感染細胞，檢測到抑制BolA3的表達能夠促進細胞進行性死亡。對其機制進行研究發(fā)現(xiàn):抑制細胞內(nèi)BolA3的表達能抑制細胞內(nèi)能量代謝中的重要分

13、子--ATP的生成。
　　研究結(jié)論:
　　1.本研究對miRNA在中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)感染致病過程中的作用進行了探索。實驗結(jié)果顯示MERS-CoV感染細胞可以影響多種宿主細胞miRNA的變化，其中MERS-CoV感染可通過促進細胞內(nèi)miR-374a的表達而靶向抑制BolA3的表達，從而影響細胞生存。
　　2.針對miR-374a的靶基因，本研究對BolA3基因在細胞中的分布、定位及其對ATP生成的