底物捕獲法檢測(cè)SHP1在MAPK信號(hào)通路中的靶蛋白.pdf

1、SHP1是一種胞質(zhì)蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein Tyrosine Phosphatase，PTP)，主要表達(dá)于造血細(xì)胞和某些上皮細(xì)胞。其在造血細(xì)胞中的主要功能是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及分化。但在某些上皮細(xì)胞或異常表達(dá)該基因的某些實(shí)體瘤細(xì)胞中，SHP1的功能尚不明確，一些研究表明SHP1正向調(diào)控EGF誘導(dǎo)MAPK信號(hào)通路的活化，促進(jìn)相應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)，但是并不清楚其具體作用機(jī)制。一個(gè)重要原因是在實(shí)體瘤細(xì)胞中并不了解SHP1參與調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通

2、路的作用底物。本研究旨在利用底物捕獲技術(shù)檢測(cè)SHP1在MAPK信號(hào)通路中的靶蛋白，并構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)SHP1底物捕獲突變體的細(xì)胞株，為SHP1在MAPK信號(hào)通路中靶蛋白的進(jìn)一步鑒定提供基礎(chǔ)。 一、底物捕獲法檢測(cè)SHP1在MAPK信號(hào)通路中的靶蛋白實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建了SHP1CSDA-Flag、SHP1DAQA-Flag、SHPlTA-Flag的SHP1底物捕獲突變體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，饑餓細(xì)胞16h后，EGF刺激細(xì)胞，細(xì)胞上清經(jīng)

3、Flag抗體免疫共沉淀，SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)印、磷酸化酪氨酸抗體免疫印跡檢測(cè)與SHP1及其突變體相互作用的信號(hào)蛋白。結(jié)果顯示EGF刺激后，在表達(dá)SHPlCSDA-Flag的HEK293細(xì)胞中，檢測(cè)到一約90KD大小酪氨酸磷酸化蛋白，而在表達(dá)野生型SHP1-Flag的HEK293細(xì)胞中則檢測(cè)不到這一蛋白，且在未經(jīng)EGF刺激的表達(dá)野生型或突變型SHP1-Flag的HEK293細(xì)胞中均未檢測(cè)到這-90KD酪氨酸磷酸化蛋白，說(shuō)明此90KD蛋

4、白可能為SHP1參與EGF活化MAPK信號(hào)通路的靶蛋白之一。 二、穩(wěn)定表達(dá)S腫lCSDA-Flag細(xì)胞株的構(gòu)建由于SHP1-Flag的CSDA雙突變體可以捕獲SHP1在MAPK信號(hào)通路中的90KD靶蛋白，但是利用一些相應(yīng)大小的抗體卻未能鑒定這一蛋白，因此必須通過(guò)其他手段鑒定該蛋白。本研究利用：Invitrogen公司的Flp-InTM系統(tǒng)建立了穩(wěn)定表達(dá)SHPlCSDA-Flag的細(xì)胞株-Flp-In TM-293-SHP1CSD