髓樣分化蛋白-2模擬肽對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬革蘭氏陰性細(xì)菌的抑制效應(yīng).pdf

1、目的：探討髓樣分化蛋白-2模擬肽（MDMP）對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬革蘭氏陰性細(xì)菌的影響及所致炎癥因子分泌的抑制效應(yīng)。
　　方法：利用PCR技術(shù)從PEGFP-C3質(zhì)粒中擴(kuò)增出表達(dá)EGFP的基因片段，通過基因重組方法構(gòu)建原核表達(dá)載體 pET-32a（+）-EGFP，經(jīng)測序鑒定后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL21（DE3）PLysS中篩選出穩(wěn)定表達(dá)的重組菌 pET-32a（+）-EGFP-BL21（ DE3） PLysS（簡稱為EGFP-BL21）。以

2、IPTG作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)重組質(zhì)粒表達(dá)后，通過免疫熒光技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)檢測RAW264.7細(xì)胞對(duì)EGFP-BL21細(xì)菌的吞噬能力以驗(yàn)證EGFP-BL21的構(gòu)建情況。進(jìn)而以EGFP-BL21作為工具，進(jìn)一步檢測RAW264.7細(xì)胞及骨髓源巨噬細(xì)胞對(duì)經(jīng)不同濃度的MDMP(1,10和100ug/ml)預(yù)處理后對(duì)EGFP-BL21的吞噬效應(yīng)；并通過ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-6的分泌水平。
　　結(jié)果：篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)

3、EGFP的重組大腸桿菌 BL21（DE3） PLysS，重組菌經(jīng)巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬后流式和激光共聚焦檢測結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的綠色熒光。MDMP預(yù)處理后，流式檢測結(jié)果顯示RAW264.7細(xì)胞及骨髓源巨噬細(xì)胞對(duì)EGFP-BL21的吞噬能力受到明顯抑制，預(yù)處理組（10,100ug/ml）的吞噬系數(shù)（PI）顯著低于經(jīng)血清調(diào)理的陽性對(duì)照組（P<0.01），且細(xì)胞培養(yǎng)上清TNF-α和IL-6的分泌水平顯著降低（P<0.01）。