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文檔簡介
1、肥胖已經(jīng)成為一個全球面臨的嚴重公共健康問題。隨著經(jīng)濟的發(fā)展和生活方式的改變,中國的肥胖人口也急劇增長,且呈起病低齡化的發(fā)展趨勢。肥胖導(dǎo)致的代謝綜合癥,更是嚴重威脅人類健康。脂肪源性間充質(zhì)干細胞(Humanmesenchymal stem cells-adipose,HMSC-Ad)、脂肪源性多能干細胞(humanmultipotent adipose-derived stem cells,hMADSCs)、前體脂肪細胞(Humanpre
2、-adipocyte,Pre-Ad)的增殖及向成熟脂肪細胞分化的機制,一直是肥胖研究的重要方向。盡管隨PPARγ、C/EBPα等一系列關(guān)鍵基因的發(fā)現(xiàn),人們對脂肪細胞增殖及成脂分化的機制有了較深理解,然而針對這些靶標(biāo)所開展的藥物研發(fā),并未在臨床上獲得良好的防治效果。因此肥胖防治仍不容樂觀,積極尋找肥胖防治的新靶標(biāo)并深入研究其相關(guān)機制仍是研究者努力的方向之一。
miR-1908,是本課題研究小組通過高通量miRNA芯片篩選的、在人
3、脂肪源性間充質(zhì)干細胞和前體脂肪細胞中表達較低、在成熟脂肪細胞中表達顯著上調(diào)的miRNA。結(jié)合Dicer(miRNA成熟的關(guān)鍵酶)脂肪特異性敲除可導(dǎo)致小鼠脂肪發(fā)育異常的報道,提示miRNA在脂肪細胞分化中的重要作用。因此,本研究首先探討miR-1908與肥胖的相關(guān)性,并通過生物信息學(xué)分析miR-1908作用的靶基因集合的功能集合和富集的信號通路,為深入開展miR-1908在肥胖發(fā)生中的功能研究提供實驗及理論基礎(chǔ);進一步以hMADSCs為研
4、究對象,探討miR-1908在hMADSCs增殖、成脂分化中的作用,并初步探索了miR-1908發(fā)揮功能的可能機制,有望為肥胖及其并發(fā)癥防治提供新線索及潛在的干預(yù)靶標(biāo)。
本文主要從以下幾方面進行論述:
第一部分 miR-1908與肥胖相關(guān)性的探討
目的:通過觀察miR-1908在脂肪細胞、肥胖/超重者脂肪組織中的表達及脂源性細胞因子對脂肪細胞中miR-1908表達的調(diào)控,對miR-1908進行生物信息學(xué)分析
5、,探討miR-1908與肥胖的相關(guān)性,為闡明miR-1908在肥胖中的作用提供理論和實驗基礎(chǔ)。
方法:人脂肪組織來源的HMSC-Ad、Pre-Ad,以胰島素、地塞米松、羅格列酮、1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(3-Isobutyl-1-methylxanthine,MIX)方案誘導(dǎo)細胞分化為成熟脂肪細胞;對成熟脂肪細胞,給予脂源性細胞因子如腫瘤壞死因子-旺(tumor necrosis factorα,TNF-α)、白介素-6(I
6、nterleukin6,IL-6)、瘦素(leptin)、抵抗素(resistin)及游離脂肪酸(free fatty acid,F(xiàn)FAs),進行干預(yù);取肥胖/超重人群(BMI≥24)皮下脂肪組織9例,以BMI(18.5-23.9)正常人群皮下脂肪組織(16例)為對照;采用Realtime PCR技術(shù)檢測miR-1908在脂肪細胞、肥胖/超重者脂肪組織中的表達水平。采用miRBase檢索miR-1908的序列特征,分析其物種保守性;采用
7、TargetScan、Pictar和miRanda數(shù)據(jù)庫檢索miR-1908的靶基因,取三者交集得到靶基因集合,對靶基因集合進行GO分析(Gene Ontology Analysis,GO Analysis)和pathway分析(Pathway Analysis)。
結(jié)果:1)miR-1908在HMSC-Ad、Pre-Ad誘導(dǎo)分化成熟的脂肪細胞中呈高表達模式;2)miR-1908在Pre-Ad誘導(dǎo)分化成熟脂肪細胞中的表達水平,
8、受脂源性細胞因子及FFAs的調(diào)控;3)與BMI正常人群相比,miR-1908高表達于肥胖/超重者腹部皮下脂肪組織;4)miR-1908具有物種保守性,對miR-1908的靶基因進行GO和pathway分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)靶基因功能主要富集于肥胖、胰島素抵抗及脂肪細胞增殖、分化密切相關(guān)的信號通路,如MAPK信號通路、胰島素信號通路、細胞周期等。
結(jié)論:miR-1908在分化成熟的脂肪細胞中高表達,并受脂源性細胞因子及FFAs的調(diào)控,m
9、iR-1908靶基因功能富集于肥胖及脂肪細胞增殖、分化相關(guān)的信號通路,提示miR-1908的功能可能與肥胖相關(guān)。
第二部分 miR-1908過表達對人脂肪源性多能干細胞的功能影響
目的:觀察miR-1908過表達對hMADSCs增殖、凋亡、細胞周期、成脂分化的影響。
方法:體外培養(yǎng)穩(wěn)定感染miR-1908慢病毒的hMADSCs,以轉(zhuǎn)染空載病毒的hMADSCs為對照,胰島素、地塞米松、羅格列酮、MIX方案誘導(dǎo)
10、細胞分化成熟。CCK-8(Cell Counting Kit-8)法檢測細胞的增殖情況;流式細胞儀檢測細胞凋亡及細胞周期;油紅O觀察hMADSCs成脂分化過程中脂滴形成情況;酶比色法檢測成熟脂肪細胞中的甘油三酯含量;采用Realtime PCR、Western Blot技術(shù),檢測脂肪細胞分化關(guān)鍵基因(PPARγ、C/EBP-α)及蛋白的表達水平。
結(jié)果:1)過表達miR-1908具有促進hMADSCs細胞增殖的作用,對hMAD
11、SCs細胞凋亡無明顯影響,在hMADSCs細胞周期中可以促進G1期向S期的進程,使更多的細胞進入S期;2)過表達miR-1908盡管下調(diào)了第15天脂肪細胞分化關(guān)鍵基因PPARγ、C/EBP-α mRNA的表達,但對hMADSCs成熟脂肪細胞中脂滴形成、甘油三酯含量、PPARγ與C/EBP-α蛋白水平無明顯影響。
結(jié)論:1)過表達miR-1908促進hMADSCs的細胞增殖;2)過表達miR-1908對hMADSCs成脂分化無顯
12、著影響。
第三部分 miR-1908調(diào)控人脂肪源性多能干細胞功能的可能機制
目的:初步探討miR-1908過表達對hMADSCs功能影響的可能機制。
方法:體外培養(yǎng)穩(wěn)定感染miR-1908慢病毒的hMADSCs,以轉(zhuǎn)染空載病毒的hMADSCs為對照;應(yīng)用基因表達譜芯片技術(shù),檢測miR-1908過表達hMADSCs中的差異表達基因;采用Realtime PCR驗證基因表達譜芯片的結(jié)果。
結(jié)果:1)過
13、表達miR-1908的hMADSCs中共有123個差異表達的基因,其中表達上調(diào)的有69個,表達下調(diào)的有54個;2)差異表達基因的分子功能涉及15個不同的組,Pathway分析則發(fā)現(xiàn)miR-1908過表達影響了胰島素信號通路與mTOR信號通路;3)驗證基因表達譜芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn),CORO6、ST14、KCNC3等差異基因表達水平顯著下調(diào),與基因表達譜芯片結(jié)果基本一致。
結(jié)論:1)以基因表達譜芯片技術(shù)檢測差異表達基因,與預(yù)測的miR-
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