Notch信號通路在骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性DC生成中的作用及分子機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景: 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，目前已經(jīng)在骨髓、臍帶、脂肪等多種組織器官中分離得到。MSCs除具備干細(xì)胞的基本特性外，還具有低免疫原性、免疫調(diào)節(jié)能力等特性，因而引起了再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。MSCs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)能力的可能機(jī)制主要是通過分泌具有抑炎作用的可溶性因子或通過細(xì)胞-細(xì)胞間的直接接觸來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。樹突狀細(xì)胞(dendriticcell，DC)由造血干細(xì)胞(hematopoi

2、etic stem cells，HSCs)發(fā)育分化而來，在先天性免疫和獲得性免疫中均有重要作用，而最近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)性DC具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)能力，在免疫系統(tǒng)中作用顯著。因此我們研究MSCs誘導(dǎo)HSCs生成具有調(diào)節(jié)作用的DC，不僅具有重要的理論意義，還為MSCs用于臨床細(xì)胞治療提供了理論依據(jù)。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonicfibroblast，MEF)來源的MSCs在無外源添加因子的情況下可通過分泌可溶性

3、因子影響調(diào)節(jié)性DC的生成。那么，骨髓來源的MSC在無外源添加因子時是否也可以誘導(dǎo)生成調(diào)節(jié)性DC還有待進(jìn)一步的研究。我們發(fā)現(xiàn)，小鼠骨髓來源的MSCs(bone marrow MSCs，BM-MSCs)高表達(dá)Notch配體，那么Notch信號通路能否影響共培養(yǎng)體系中調(diào)節(jié)性DC的生成值得進(jìn)一步深入研究。本論文致力于研究Notch通路在調(diào)節(jié)性DC生成過程中的作用及其詳細(xì)的分子機(jī)制。
　　研究目的: 基于上述研究現(xiàn)狀和提示，我們系統(tǒng)地研究了

4、BM-MSCs誘導(dǎo)HSCs生成調(diào)節(jié)性DC的詳細(xì)分子機(jī)制。1.研究BM-MSCs誘導(dǎo)生成調(diào)節(jié)性DC的免疫表型、轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)情況和因子分泌情況。2.研究這種調(diào)節(jié)性DC在體內(nèi)外的免疫調(diào)節(jié)功能及對結(jié)腸炎模型(Inflammatory bowel disease，IBD)的治療作用。3.研究Notch通路在BM-MSCs誘導(dǎo)生成調(diào)節(jié)性DC過程中的作用及其詳細(xì)分子機(jī)制。
　　研究方法: 1.利用磁珠分選純化獲得BM-MSCs，運(yùn)用ELISA、

5、qRT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)研究其生物學(xué)特性。2.在體外BM-MSCs與HSCs共培養(yǎng)誘導(dǎo)生成一種DC，命名為sBM-DCs，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測sBM-DCs的表型，Western blot和qRTPCR分別在蛋白和mRNA水平上檢測轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)情況，ELISA檢測細(xì)胞因子分泌情況。3.利用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)和遲發(fā)型超敏反應(yīng)(Delayedhypersensitivity, DTH)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其在體內(nèi)外的免疫調(diào)節(jié)能力，并用流式細(xì)胞術(shù)研究對T細(xì)胞

6、活化標(biāo)志的影響。4.通過HE染色、ELISA研究sBM-DCs對IBD模型的治療作用，并用流式細(xì)胞術(shù)研究sBM-DCs發(fā)揮作用的機(jī)制。5.在共培養(yǎng)體系中加入Notch通路抑制劑DAPT，通過流式細(xì)胞術(shù)、Western blot、ELISA研究細(xì)胞生物學(xué)特性的變化，并通過混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究其免疫調(diào)節(jié)能力的變化。6.采用siRNA干擾技術(shù)敲低BM-MSCs的Notch配體后，之后再與HSCs共培養(yǎng)，研究生成細(xì)胞與sBM-DCs的差異。

7、7.利用病毒感染、Chip和Co-IP實(shí)驗(yàn)研究Notch通路起作用的詳細(xì)機(jī)制。8.利用Chip實(shí)驗(yàn)研究表觀遺傳調(diào)控在sBM-DCs生成過程的影響。
　　研究結(jié)果: 我們首先發(fā)現(xiàn)，在無外源細(xì)胞因子的情況下，BM-MSCs與HSCs共培養(yǎng)誘導(dǎo)生成一種新型調(diào)節(jié)性sBM-DCs:該細(xì)胞高表達(dá)CD11b，低表達(dá)CD11c、CD40、CD80、CD86、Ia; PU.1、Ikaros、RBP-J中度表達(dá)， IRF4、IRF8、Batf3、Sp

8、iB、TCF4低表達(dá)，Relb、TRAF6、c-Maf、 MafB不表達(dá);同時還發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)的吞噬能力，可分泌較高水平的IL-10。
　　sBM-DCs在體內(nèi)外具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)能力:在體外，sBM-DCs可以抑制同種淋巴細(xì)胞增殖，抑制T細(xì)胞活化標(biāo)志CD44和CD69的表達(dá);在體內(nèi)，sBM-DCs可以明顯減輕DTH反應(yīng)，還對IBD小鼠的腸炎具有一定的治療作用。進(jìn)一步研究結(jié)果表明，此治療作用可能與增加抑炎因子IL-10的分泌、降低炎

9、癥因子IL-2和TNF-α的分泌及增加CD4+CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例有關(guān)。
　　Notch通路在sBM-DCs生成過程中發(fā)揮著重要作用，加入Notch通路抑制劑DAPT和干擾BM-MSCs的Notch配體Jagged1阻斷Notch通路后，所生成細(xì)胞變化結(jié)果類似:CD11b顯著降低，CD40、CD80、CD86和Ia有不同程度地升高;Ikaros和RBP-J表達(dá)水平降低，IRF8、TCF4和TRAF6呈不同程度地升高;分泌的I

10、L-10降低、IL-12升高;免疫調(diào)節(jié)能力基本喪失。
　　進(jìn)一步研究結(jié)果表明，Notch通路通過RBP-J和表觀遺傳調(diào)控抑制IRF8的表達(dá)進(jìn)而抑制炎癥因子的分泌對sBM-DCs生成必不可少:干擾IRF8的表達(dá)后，IL-12的mRNA和蛋白水平表達(dá)均降低，IRF8可通過與IL-12的啟動子直接結(jié)合來調(diào)控IL-12的表達(dá);干擾RBP-J的表達(dá)后，IRF8的mRNA和蛋白水平表達(dá)均下調(diào)，表明IRF8和RBP-J的表達(dá)存在密切關(guān)聯(lián)，再加入

11、DAPT并不能升高IRF8的表達(dá)，進(jìn)一步說明Notch通路通過RBP-J控制IRF8的表達(dá);在sBM-DCs生成過程中，RBP-J處于去乙酰化狀態(tài)抑制IRF8的表達(dá)，加入DAPT后，RBP-J處于乙?；癄顟B(tài)，上調(diào)IRF8的表達(dá);Notch通路還可以改變IRF8基因的組蛋白修飾狀態(tài)，控制其表達(dá)水平。
　　結(jié)論: 1.在無外源添加因子的情況下，BM-MSCs誘導(dǎo)HSCs生成一種新型sBM-DCs，具有較低免疫原性、較強(qiáng)的吞噬能力;表達(dá)