SMG-1在正常和-或缺氧條件下與絨癌JAR細(xì)胞系凋亡關(guān)系的研究.pdf

1、滋養(yǎng)細(xì)胞是母胎界面進(jìn)行物質(zhì)交換的主要場(chǎng)所，是構(gòu)成胎盤的主要成分。在妊娠早期，胎盤氧分壓處于較低水平，妊娠8~13周時(shí)，隨著滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)，子宮螺旋動(dòng)脈發(fā)生重塑，絨毛間氧分壓增加，以此維持滋養(yǎng)細(xì)胞正常著床。若胎盤持續(xù)處于低氧狀態(tài)，滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等將會(huì)發(fā)生異常改變，多種妊娠期疾病，如子癇前期（PE）和胎兒生長(zhǎng)受限（FGR）等，發(fā)生胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲過(guò)淺，血流灌注受限，胎盤淺著床，并引發(fā)滋養(yǎng)細(xì)胞過(guò)度凋亡，嚴(yán)重影響妊娠結(jié)局。

2、r>　　生殖器形成抑制基因-1（SMG-1）屬于PI3K相關(guān)激酶（PIKK）家族，是一種絲氨酸\蘇氨酸激酶。SMG-l基因編碼含有3031個(gè)氨基酸殘基的蛋白，該蛋白包含一個(gè)保守的激酶結(jié)構(gòu)域、一個(gè)PIK相關(guān)激酶特有的C-末端結(jié)構(gòu)域以及FK506結(jié)合蛋白12-雷帕霉素復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域。最初研究者認(rèn)為其參與無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解（NMD）途徑。隨著研究深入發(fā)現(xiàn)SMG-1參與細(xì)胞內(nèi)缺氧和DNA損傷等應(yīng)激反應(yīng)，可調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡等多項(xiàng)生理

3、功能，并對(duì)抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有一定潛在作用。
　　信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（Stat3）是細(xì)胞內(nèi)一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，Stat3的C-端包含一個(gè)705位點(diǎn)的酪氨酸殘基（TryY705），其被酪氨酸激酶激活時(shí)，如JAK和Scr，Stat3將會(huì)沿著酪氨酸級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)生磷酸化；此外，Stat3的C-端還有一個(gè)727位點(diǎn)的絲氨酸殘基（Ser727），由絲氨酸激酶激活，如mTOR、蛋白激酶C和CDK5，以此來(lái)最大化激活下游的轉(zhuǎn)錄基因。激活的

4、磷酸化 Stat3（p-Stat3）可調(diào)控機(jī)體細(xì)胞生理活動(dòng)的基因轉(zhuǎn)錄，如細(xì)胞增殖、炎癥、侵襲和凋亡等，p-Stat3在某些病理狀態(tài)下發(fā)生異常表達(dá)，如腫瘤和子癇前期。人們還發(fā)現(xiàn)Stat3在許多缺氧細(xì)胞模型以及動(dòng)物模型中參與細(xì)胞功能的調(diào)控。
　　人們常將滋養(yǎng)細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞系作為研究滋養(yǎng)細(xì)胞功能的細(xì)胞模型。JAR細(xì)胞來(lái)源于滋養(yǎng)細(xì)胞系，為人類絨毛膜癌的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，是研究滋養(yǎng)細(xì)胞功能的細(xì)胞模型之一。由于胎盤原代滋養(yǎng)細(xì)胞一般取自足月產(chǎn)的胎盤或早

5、孕期的流產(chǎn)胎盤，此時(shí)滋養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量有限，體外生長(zhǎng)增殖能力低下，在普通培養(yǎng)基中不易貼壁生長(zhǎng)，難以達(dá)到實(shí)驗(yàn)研究需求細(xì)胞的穩(wěn)定狀態(tài)，故國(guó)內(nèi)外通常選取人絨癌系細(xì)胞來(lái)作為研究對(duì)象。
　　目的:本研究采用流式細(xì)胞術(shù)、熒光定量 PCR和蛋白印跡等方法，檢測(cè) SMG-1在常氧條件和/或缺氧條件下對(duì)絨癌JAR細(xì)胞系凋亡水平和Stat3、p-Stat3表達(dá)水平的影響，初步探討 SMG-1在正常和/或缺氧環(huán)境中與 JAR細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。
　　材

6、料和方法:
　　1.研究對(duì)象:絨癌JAR細(xì)胞系（ATCC，HTB-144）購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物科技公司，使用DMEM-H、10％ FBS、100 U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的完全培養(yǎng)基（Genview，美國(guó)），培養(yǎng)于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱。
　　2.方法:將JAR細(xì)胞接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板，生長(zhǎng)融合至70%時(shí)，在常氧條件（37℃、5%CO2，95%空氣）下和采用CoCl2建立JAR細(xì)胞缺氧條件下，進(jìn)行以下分組：①

7、常氧條件分組：轉(zhuǎn)染SMG-1 siRNA組、轉(zhuǎn)染siRNA空載質(zhì)粒（陰性對(duì)照組）和空白對(duì)照組；②缺氧條件分組：正常組和缺氧處理組。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平；采用熒光定量 PCR實(shí)驗(yàn)（Real time-PCR）和免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western Blot）檢測(cè)細(xì)胞中SMG-1、Stat3的mRNA表達(dá)水平以及SMG-1、Stat3和p-Stat3蛋白的表達(dá)水平。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以?

8、x±s表示，熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用2-ΔΔCT方法分析，多組數(shù)據(jù)分析時(shí)采用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)分析時(shí)運(yùn)用配對(duì)設(shè)計(jì)定量資料的t檢驗(yàn)。以α=0.05作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　　1.常氧條件下SMG-1對(duì)JAR細(xì)胞凋亡率的影響:在常氧條件（37℃，5%CO2，95%空氣）下，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SMG-1的siRNA沉默SMG-1的表達(dá)后，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，SMG-1的siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率為（14.69

9、±2.641）%，空白對(duì)照組為（5.43±1.043）%，陰性對(duì)照組為（7.26±1.214）%。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即抑制SMG-1的表達(dá)后，JAR細(xì)胞凋亡水平增加。
　　2.常氧條件下SMG-1對(duì)JAR細(xì)胞Stat3 mRNA的表達(dá)影響:在常氧條件下，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SMG-1的siRNA沉默SMG-1的表達(dá)后，利用熒光定量PCR檢

10、測(cè)SMG-1和Stat3的mRNA表達(dá)水平結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組SMG-1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平為0.430±0.040，陰性對(duì)照組的SMG-1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平為0.949±0.047。與空白對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組SMG-1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；轉(zhuǎn)染組的Stat3的mRNA相對(duì)表達(dá)水平為0.667±0.069，陰性對(duì)照組為1.083±0.147，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組的Stat3的mRNA相對(duì)表達(dá)水平

11、降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即抑制SMG-1的表達(dá)后，JAR細(xì)胞Stat3 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平降低。
　　3.常氧條件下SMG-1對(duì)JAR細(xì)胞Stat3和p-Stat3蛋白的表達(dá)影響:在常氧條件下，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SMG-1的siRNA沉默SMG-1的表達(dá)后，利用Western Blot檢測(cè)Stat3和p-Stat3的蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組Stat3的蛋白表達(dá)水平為1.056±0.022，陰性對(duì)照組為1.872±0.036，空

12、白對(duì)照組為1.789±0.046，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組Stat3的蛋白表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；轉(zhuǎn)染組 p-Stat3的蛋白表達(dá)水平為0.157±0.026，空白對(duì)照組為0.430±0.010，陰性對(duì)照組為0.326±0.043，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組p-Stat3的蛋白表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即抑制SMG-1的表達(dá)后，JAR細(xì)胞Stat3和p-Stat3的蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低。

13、　　4.缺氧條件下JAR細(xì)胞凋亡率的表達(dá)情況:通過(guò) CoCl2使 JAR細(xì)胞缺氧后，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平結(jié)果顯示，缺氧處理組的細(xì)胞凋亡率為（17.83±2.041）%，與對(duì)照組（4.02±1.242)%相比，缺氧處理組的細(xì)胞凋亡率升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即缺氧后JAR細(xì)胞凋亡水平增加。
　　5.缺氧條件下JAR細(xì)胞SMG-1和Stat3 mRNA的表達(dá)情況:通過(guò)CoCl2使JAR細(xì)胞缺氧后，利用熒光定量PCR檢測(cè)SMG

14、-1和Stat3的mRNA表達(dá)水平結(jié)果顯示，缺氧處理組 SMG-1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平為3.569±0.264，與正常組相比，缺氧處理組SMG-1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；缺氧處理組 Stat3的mRNA相對(duì)表達(dá)水平為1.699±0.243，高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即缺氧后JAR細(xì)胞SMG-1和Stat3的mRNA相對(duì)表達(dá)水平均增加。
　　6.缺氧條件下JAR細(xì)胞SMG-1、Stat3和p-Stat

15、3蛋白的表達(dá)情況:通過(guò)CoCl2使JAR細(xì)胞缺氧后，利用Western Blot檢測(cè)SMG-1、Stat3和p-Stat3的蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示，缺氧處理組SMG-1的蛋白水平為0.435±0.020，正常組為0.260±0.003，缺氧處理組與正常組相比，SMG-1的蛋白表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；缺氧處理組 Stat3的蛋白水平為1.274±0.024，p-Stat3的蛋白水平為0.822±0.065，與正常組相比表達(dá)降低，差