雙氫青蒿素調節(jié)核糖體蛋白L23抑制胃癌MKN45細胞增殖的機制研究.pdf

1、目的：研究雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）對胃癌MKN45細胞增殖、凋亡的影響，并探索其可能的機制，明確DHA在胃癌治療中的可行性及其作用的發(fā)揮與核糖體蛋白 L23(Ribosome protein L23, RPL23)活性狀態(tài)是否存在關系。
　　方法：(1)根據Pubmed人RPL23基因序列，設計3條引物，通過脂質體轉染化學合成的 RPL23-siRNA干擾片段，使用實時熒光定量 PCT（Real-

2、time PCR, RT-PCR）、蛋白印記實驗（Western blot, WB）進行干擾效率鑒定；(2)使用不同濃度梯度的DHA作用MKN45細胞，MTT實驗檢測細胞增殖情況，確定DHA的半數抑制濃度（Half maximal inhibitory concentration, IC50）；(3)使用DHA及siRNA轉染共處理MKN45細胞，將實驗分為4組：對照組（NC組）、 RPL23-siRNA組、DHA組、DHA+RPL23

3、-siRNA組，用甲基噻唑基四唑(Methylcyclopentadienyl Manganese Tricarbonyl, MTT)實驗測定細胞增殖、流式細胞術(Flow cytometry, FCM）測定細胞凋亡及細胞周期，激光共聚焦掃描顯微鏡(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)觀察細胞中 RPL23、鼠雙微體2（Murine double minute2, MDM2）蛋白定位，WB實驗

4、檢測RPL23、MDM2、B細胞易位基因2（B cell translation gene2, BTG2）、細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）表達；(4)實驗數據采取均數±標準差（-x±s）， SPSS19.0進行統(tǒng)計分析。
　　結果：(1)構建并篩選出最佳RPL23-siRNA干擾片段： RT-PCR鑒定結果顯示，正常細胞組、對照組、siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組5組中RPL23 mRNA表達水平具有具有顯著

5、統(tǒng)計學差異（P<0.01），多重比較發(fā)現，siRNA1組干擾效率明顯高于RPL23-siRNA2組（P<0.01）及RPL23-siRNA3組（P<0.01），WB鑒定與上述結果一致，可以認為，siRNA1是最佳干擾序列，可用于后續(xù)實驗。(2) DHA IC50值的確定：MTT實驗檢測了不同濃度梯度的DHA對于MKN45增殖的影響，MKN45的抑制率與藥物濃度之間呈現出劑量依賴性，隨著藥物濃度的增加，MKN45細胞的抑制率隨之增加，當D

6、HA濃度為160um/L時，細胞增殖抑制率為50％左右，說明，160um/L可作為DHA的IC50值。(3) MTT實驗及FCM實驗顯示，DHA可明顯抑制胃癌MKN45增殖，誘導細胞凋亡， NC組、RPL23-siRNA組、DHA組、DHA+RPL23-siRNA組細胞的平均凋亡率之間存在統(tǒng)計學差異（P<0.01）。細胞周期實驗顯示，4組細胞數在 G1期、S期均表現出統(tǒng)計學差異（P<0.01），RPL23抑制表達后，MKN45細胞的G1

7、期細胞數目減少，S期細胞數目增多，說明RPL23-siRNA促進了細胞周期G1/S期轉化，而經過DHA再次處理后，則出現了不同程度的G1/S期轉化抑制。用激光共聚焦顯微鏡觀察到，正常的MKN45細胞中，RPL23主要表達在細胞漿，MDM2則主要表達于細胞核漿，使用RPL23-siRNA轉染后，細胞漿中的RPL23明顯降低，而MDM2則出現了細胞核中的濃聚，而DHA處理后，兩組細胞中的RPL23再次出現了胞漿中的不同程度濃聚，而MDM2則