雙氫青蒿素調(diào)節(jié)核糖體蛋白L23抑制胃癌MKN45細(xì)胞增殖的機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）對(duì)胃癌MKN45細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探索其可能的機(jī)制，明確DHA在胃癌治療中的可行性及其作用的發(fā)揮與核糖體蛋白 L23(Ribosome protein L23, RPL23)活性狀態(tài)是否存在關(guān)系。
　　方法：(1)根據(jù)Pubmed人RPL23基因序列，設(shè)計(jì)3條引物，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的 RPL23-siRNA干擾片段，使用實(shí)時(shí)熒光定量 PCT（Real-

2、time PCR, RT-PCR）、蛋白印記實(shí)驗(yàn)（Western blot, WB）進(jìn)行干擾效率鑒定；(2)使用不同濃度梯度的DHA作用MKN45細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，確定DHA的半數(shù)抑制濃度（Half maximal inhibitory concentration, IC50）；(3)使用DHA及siRNA轉(zhuǎn)染共處理MKN45細(xì)胞，將實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組（NC組）、 RPL23-siRNA組、DHA組、DHA+RPL23

3、-siRNA組，用甲基噻唑基四唑(Methylcyclopentadienyl Manganese Tricarbonyl, MTT)實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry, FCM）測(cè)定細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期，激光共聚焦掃描顯微鏡(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)觀察細(xì)胞中 RPL23、鼠雙微體2（Murine double minute2, MDM2）蛋白定位，WB實(shí)驗(yàn)

4、檢測(cè)RPL23、MDM2、B細(xì)胞易位基因2（B cell translation gene2, BTG2）、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）表達(dá)；(4)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）， SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：(1)構(gòu)建并篩選出最佳RPL23-siRNA干擾片段： RT-PCR鑒定結(jié)果顯示，正常細(xì)胞組、對(duì)照組、siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組5組中RPL23 mRNA表達(dá)水平具有具有顯著

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），多重比較發(fā)現(xiàn)，siRNA1組干擾效率明顯高于RPL23-siRNA2組（P<0.01）及RPL23-siRNA3組（P<0.01），WB鑒定與上述結(jié)果一致，可以認(rèn)為，siRNA1是最佳干擾序列，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(2) DHA IC50值的確定：MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了不同濃度梯度的DHA對(duì)于MKN45增殖的影響，MKN45的抑制率與藥物濃度之間呈現(xiàn)出劑量依賴性，隨著藥物濃度的增加，MKN45細(xì)胞的抑制率隨之增加，當(dāng)D

6、HA濃度為160um/L時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率為50％左右，說明，160um/L可作為DHA的IC50值。(3) MTT實(shí)驗(yàn)及FCM實(shí)驗(yàn)顯示，DHA可明顯抑制胃癌MKN45增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡， NC組、RPL23-siRNA組、DHA組、DHA+RPL23-siRNA組細(xì)胞的平均凋亡率之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)顯示，4組細(xì)胞數(shù)在 G1期、S期均表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），RPL23抑制表達(dá)后，MKN45細(xì)胞的G1

7、期細(xì)胞數(shù)目減少，S期細(xì)胞數(shù)目增多，說明RPL23-siRNA促進(jìn)了細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)化，而經(jīng)過DHA再次處理后，則出現(xiàn)了不同程度的G1/S期轉(zhuǎn)化抑制。用激光共聚焦顯微鏡觀察到，正常的MKN45細(xì)胞中，RPL23主要表達(dá)在細(xì)胞漿，MDM2則主要表達(dá)于細(xì)胞核漿，使用RPL23-siRNA轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞漿中的RPL23明顯降低，而MDM2則出現(xiàn)了細(xì)胞核中的濃聚，而DHA處理后，兩組細(xì)胞中的RPL23再次出現(xiàn)了胞漿中的不同程度濃聚，而MDM2則