肝臟特有CXCR3+CXCR6+γδT細胞亞群的發(fā)現(xiàn)及HBV感染時轉(zhuǎn)錄因子對免疫細胞受體及配體表達調(diào)控的研究.pdf

1、研究目的:
　　近年來，越來越多的證據(jù)表明，肝臟不僅是機體最大的代謝解毒器官，也是機體重要的免疫器官，并且具有獨特的免疫學(xué)特點。肝臟獨特的生理功能、解剖結(jié)構(gòu)和組織微環(huán)境促使其含有獨特的免疫細胞組成、細胞亞群和功能分子，形成了獨特區(qū)域免疫的特性，這些特點也促使肝臟成為以天然免疫細胞(NK、NKT和γδ T細胞)占優(yōu)勢的免疫器官?，F(xiàn)已在肝臟內(nèi)發(fā)現(xiàn)一群具有組織特異性的CD49a+DX5-NK細胞，這群細胞只在肝臟大量聚集并具有不同于外周

2、血和其他部位NK細胞的獨特表型和功能特點，其他天然免疫細胞是否亦能夠特異性存在肝臟并具有獨特的表型和功能特點尚缺乏系統(tǒng)研究。
　　γδ T細胞是一個具有天然免疫特性的獨特的免疫細胞群體，其在淋巴細胞中所占比例雖低，但應(yīng)答迅速，在面對外來微生物感染或應(yīng)激狀態(tài)下能夠迅速產(chǎn)生細胞因子，發(fā)揮抗細菌、病毒感染和抗腫瘤的作用，被視為機體免疫防御和免疫監(jiān)視的第一道防線。γδ T細胞在肝臟中的比例遠高于外周血，約占肝臟T細胞的15-25％左右，肝

3、臟獨特的區(qū)域免疫學(xué)特性亦賦予肝臟γδ T細胞不同于其他部位γδT細胞的功能特點，但肝臟中是否含有特異性駐留于肝臟的γδ T細胞以及它們在維持肝臟獨特的免疫微環(huán)境中的作用尚不清楚。
　　在HBV慢性感染發(fā)生時，可使肝臟的免疫耐受狀態(tài)加重，抑制肝臟微環(huán)境中免疫細胞（包括CD8+T細胞和NK細胞）的功能，甚至導(dǎo)致這些細胞功能耗竭，主要表現(xiàn)為細胞數(shù)量和分泌的細胞因子減少、細胞活化降低，同時伴隨著細胞表面活化性受體表達下降和抑制性受體表達升

4、高。免疫細胞功能的減弱促進了HBV逃逸免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊，但HBV逃逸免疫細胞攻擊的確切機制尚不明確。
　　本研究一方面通過比較小鼠肝臟、脾臟、胸腺和小腸上皮內(nèi)γδ T細胞的表型差異發(fā)現(xiàn)了一群僅存在于肝臟中的CXCR3+CXCR6+γδ T細胞亞群，這群細胞具有肝臟駐留的特性。在小鼠HBV急性感染模型中，肝臟CXCR3+CXCR6+γδ T細胞的比例和分泌IFN-γ的水平均增高，提示這群細胞在抵抗HBV急性感染中的重要作用。另一

5、方面，我們發(fā)現(xiàn)HBV慢性感染時轉(zhuǎn)錄因子Eomes可促進CD8+T細胞表面抑制性受體的表達，促進T細胞耗竭和HBV免疫逃逸;轉(zhuǎn)錄因子 GATA-2和GATA-3可與HBx蛋白形成三聚體進而抑制NKG2D配體MICA的表達，削弱NK細胞對HBV感染的肝癌細胞的殺傷能力，促使HBV感染的肝癌細胞逃逸NK細胞的殺傷。
　　方法:
　　1.流式細胞術(shù)檢測了C57BL/6J小鼠肝臟、脾臟、胸腺、骨髓、外周血和小腸上皮內(nèi)γδ T細胞的比例

6、。
　　2.Q-PCR和流式細胞術(shù)檢測C57BL/6J小鼠肝臟、脾臟、胸腺和小腸上皮內(nèi)γδ T細胞表面的趨化因子受體、粘附分子、與細胞因子分泌相關(guān)的標記和細胞表面受體的表達。
　　3.流式細胞術(shù)檢測成年鼠肝臟中CXCR3+CXCR6+γδ T細胞的比例、細胞表面駐留相關(guān)標記和細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的表達。
　　4.RT-PCR檢測胎鼠和成年鼠胸腺和肝臟中γT細胞的亞群，流式細胞術(shù)檢測胎鼠到成年鼠各個階段胸腺和肝臟中γδ T細胞

7、的比例、CXCR3+CXCR6+γδ T細胞的比例、細胞表面駐留相關(guān)標記和細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的表達。
　　5.建立CD45.1和CD45.2聯(lián)體小鼠模型，流式細胞術(shù)檢測CD45.1+和CD45.2+的CXCR3+CXCR6+γδ T在CD45.1和CD45.2小鼠體內(nèi)的分布。
　　6.灌流法提取小了鼠肝竇內(nèi)皮細胞并進行體外培養(yǎng)，24h后收集上清，ELISA檢測收集的上清中趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCL1

8、6的水平;Transwell法檢測肝竇內(nèi)皮細胞對CXCR3+CXCR6+γδ T細胞的趨化作用。
　　7.灌流法提取小鼠肝竇內(nèi)皮細胞，流式細胞術(shù)檢測肝竇內(nèi)皮細胞表面integrinβ7的表達。
　　8.分離小鼠肝淋巴細胞，體外經(jīng)PMMion刺激，BFA阻斷細胞因子分泌后，流式細胞術(shù)檢測CXCR3+CXCR6+γδ T細胞分泌IFN-γ和IL-17的水平及轉(zhuǎn)錄因子RORγt和T-bet的表達。
　　9.流式細胞術(shù)分選肝臟

9、和胸腺中處于發(fā)育不同階段的T細胞前體，Q-PCR檢測轉(zhuǎn)錄因子Eomes、PU.1、PLZF、Sox13、Rorc、Sox4和Id3的表達。
　　10.分離C57BL/6J和GKO小鼠肝淋巴細胞，流式細胞術(shù)檢測CXCR3+CXCR6+γδT的比例。
　　11.尾靜脈高壓注射pAAVHBV1.2質(zhì)粒建立小鼠HBV急性感染模型，分別在感染后的3d、7d、10d和14d檢測CXCR3+CXCR6γδT的比例和分泌IFN-γ和IL-1

10、7的水平。
　　12.流式細胞術(shù)分選CXCR3十CXCR6+γδ T細胞，過繼轉(zhuǎn)輸?shù)絋CRδ-/-鼠中，分別以WT鼠、TCRδ-/-鼠和過繼轉(zhuǎn)輸CXCR3+CXCR6+γδ T的TCRδ-/-鼠建立HBV急性感染模型，在高壓注射HBV后0.5W、1W、2W、3W和4W時尾靜脈取血，分離血清，化學(xué)發(fā)光法檢測血清中HBsAg和HBeAg的含量。
　　13.建立小鼠HBV慢性感染模型，流式細胞術(shù)檢測CXCR3+CXCR6+γδ T

11、細胞比例和分泌細胞因子的水平，以及CXCR3+CXCR6+γδ T細胞表面活化性受體CD69和抑制性受體PD-1、LAG-3和CTLA4的表達。
　　14.建立小鼠HBV慢性感染模型，分離肝臟和脾臟淋巴細胞后，用流式細胞術(shù)檢測了CD4+T和CD8+T細胞表面抑制性受體BTLA、CD160、Tim-3、CTLA4、PD-1和LAG-3的表達。
　　15.建立小鼠HBV的慢性感染模型，分離肝臟和脾臟淋巴細胞后，流式細胞術(shù)檢測Eo

12、mes+CD8+T細胞、EomesCD8+T細胞、Eomes+HBV特異性CD8+T細胞和Eomes-HBV特異性CD8+T細胞表面抑制性受體BTLA、CD160、Tim-3、CTLA4、PD-1和LAG-3的表達。
　　16.分別在WT和EKO小鼠中建立HBV慢性感染模型，分離小鼠肝淋巴細胞后，流式細胞術(shù)檢測CD8+T細胞和HBV特異性CD8+T細胞表面抑制性受體的表達。
　　17.分別在WT和EKO小鼠中建立HBV慢性感

13、染模型，分離肝臟淋巴細胞體外經(jīng)PMA/ion刺激、BFA阻斷細胞因子分泌后，用流式細胞術(shù)檢測HBV特異性CD8+T細胞分泌TNF-α、IL-2和IFN-γ的水平。
　　18.分別在WT和EKO小鼠中建立HBV慢性感染模型，在尾靜脈高壓注射HBV質(zhì)粒后3W、4W、5W、6W和12W尾靜脈取血，化學(xué)發(fā)光法檢測血清中HBsAg、HBeAg水平和HBV DNA的載量，用免疫組化檢測HBV慢性感染模型建立成功的C57BL/6J小鼠和EKO小

14、鼠肝組織中HBcAg的含量。
　　19.提取WT和EKO小鼠肝淋巴細胞，Q-PCR檢測NFATc1、Blimp1、FoxO1和Nfil3的水平，Westem Blot技術(shù)檢測NFATc1的表達。
　　20.染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測Eomes與肝淋巴細胞中CD160和LAG-3啟動子的結(jié)合。
　　21.以HepG2、HepG2.2.15、HepG2-N1和HepG2-HBV為研究對象，用Q-PCR和流式細胞術(shù)檢測細胞中N

15、KG2D配體的表達。
　　22.以HepG2、HepG2-HBV和HepG2.2.15為研究對象，加入MICA/B和NKG2D的阻斷抗體后，CFSE/7AAD法檢測NKL細胞對其的殺傷活性。
　　23.HepG2細胞轉(zhuǎn)染pEGFP-HBx、pEGFP-HBc、pEGFP-HBs和pEGFP-HBp后，Western Blot技術(shù)檢測肝癌細胞表面MICA的表達。
　　24.以HepG2-N1、HepG2-X和HepG2-

16、C為研究對象，加入MICA/B和NKG2D的阻斷抗體后，CFSE/7AAD法檢測NKL細胞對其的殺傷活性。
　　25.用GATA-2 siRNA和GATA-3 siRNA沉默HepG2細胞GATA-2和GATA-3的表達，Western Blot技術(shù)檢測MICA的表達。
　　26.免疫共沉淀技術(shù)檢測HBx、GATA-2和GATA-3是否可形成三聚體。
　　27.染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測HBc蛋白是否可與MICA和MIC

17、B啟動子中的CpG島區(qū)結(jié)合。
　　結(jié)果:
　　一、肝臟特有的CXCR3+CXCR6+γδ T細胞亞群的發(fā)現(xiàn)
　　1.肝臟存在特有的γδ T細胞
　　流式細胞術(shù)檢測C57BL/6J小鼠的骨髓、小腸上皮內(nèi)、淋巴結(jié)、肝臟、皮膚、脾臟和胸腺內(nèi)γδ T細胞的比例，發(fā)現(xiàn)除了富含γδ T細胞的皮膚和小腸上皮外，肝臟內(nèi)γδT細胞的比例也很高，說明肝臟也是富含γδ T細胞的器官之一。同時，比較了裸鼠和C57BL/6J小鼠小腸上皮、

18、淋巴結(jié)、肝臟和脾臟中γδ T細胞的比例，發(fā)現(xiàn)裸鼠肝臟中依然存在γδT細胞，雖然比例低于C57BL/6J小鼠，這說明肝臟中存在一群特有的γδT細胞，它們的存在不受胸腺的影響。
　　2.肝臟中存在CXCR3+CXCR6+γδ T細胞亞群
　　Q-PCR和流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)CXCR3和CXCR6在肝臟中特異性高表達，進而發(fā)現(xiàn)了一群只在肝臟中存在的CXCR3+CXCR6+γδ T細胞亞群，流式細胞術(shù)檢測這群細胞的表面標記和轉(zhuǎn)錄因子，

19、發(fā)現(xiàn)這群細胞表達的細胞駐留性標記 CD103、CD69、CD44、CD49a和PLZF的水平較高，提示肝臟中CXCR3+CXCR6+γδT細胞可能是駐留在肝臟的，是肝臟特有的—群γδT細胞。
　　3.CXCR3+CXCR6+γδ T細胞亞群從胚胎期一直存在
　　首先，我們用普通PCR檢測了胚胎和成年時期肝臟和胸腺內(nèi)γδ T細胞的亞群，發(fā)現(xiàn)胚胎期間肝臟一直存在Vγ2和Vγ4的γδ T細胞，用流式細胞術(shù)進一步驗證了小鼠從胚胎期到

20、成年一直存在γδ T細胞，并且CXCR3+CXCR6+γδT細胞亞群從胚胎到成年也一直存在。
　　接下來，我們發(fā)現(xiàn)胚胎期到成年期CXCR3+CXCR6+γδ T細胞亞群的駐留相關(guān)的標記和轉(zhuǎn)錄因子表達一致，說明這群細胞從胚胎時期一直駐留在肝臟中，是肝臟特有的γδ T細胞亞群。
　　4.CXCR3+CXCR6+γδ T細胞是特異性駐留于肝臟的γδ T細胞亞群
　　在CD45.1和CD45.2聯(lián)體小鼠模型中發(fā)現(xiàn)CD45.1+

21、的CXCR3+CXCR6+γδ T幾乎全部存在于CD45.1小鼠肝臟中，CD45.2+的CXCR3+CXCR6+γδ T也幾乎全部存在于CD45.2小鼠肝臟中，說明CD45.1+和CD45.2+的CXCR3+CXCR6+γδ T細胞沒有進入體循環(huán)，是駐留于小鼠肝臟中的。
　　5.肝竇內(nèi)皮細胞促進CXCR3+CXCR6+γδT細胞在肝臟駐留
　　ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠肝竇內(nèi)皮細胞分泌高水平的CXCL9、CXCL11和CXCL1

22、6。Transwell實驗證明肝竇內(nèi)皮細胞可通過分泌CXCL9、CXCL11和CXCL16募集CXCR3+CXCR6+γδ T，中和CXCL9、CXCL11和CXCL16后，肝竇內(nèi)皮細胞對CXCR3+CXCR6+γδ T細胞的募集作用減弱，而肝竇內(nèi)皮細胞表面的integrinβ7與CD103結(jié)合促進CXCR3+CXCR6+γδ T細胞的駐留。
　　6.CXCR3+CXCR6+γδ T細胞是分泌IFN-為主的細胞
　　流式細胞

23、術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCR3+CXCR6+γδ T細胞分泌IFN-γ的水平高于IL-17，并且轉(zhuǎn)錄因子T-bet的表達高于RORγt。肝臟T細胞前體中調(diào)控IFN-γ分泌的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子高于調(diào)控IL-17分泌的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。
　　7.IFN-γ缺失不影響CXCR3+CXCR6+γδ T細胞的比例
　　GKO小鼠肝臟中CXCR3+CXCR6+γδ T細胞沒有變化，說明小鼠缺失IFN-γ不影響CXCR3+CXCR6+γδ T細胞的比例。

24、
　　8.CXCR3+CXCR6+γδ T細胞參與抵抗HBV急性感染
　　流式細胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV急性感染早期CXCR3+CXCR6+γδ T細胞分泌的IFN-γ減少，HBV急性感染7d以后，CXCR3+CXCR6+γδ T細胞分泌的IFN-γ增加。向TCRδ-/-鼠中轉(zhuǎn)輸CXCR3+CXCR6+γδ T細胞后發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)HBsAg和HBeAg的量明顯降低，說明CXCR3+CXCR6+γδ T細胞可參與抵抗HBV急性感染，并

25、且在一定條件下產(chǎn)生IL-17增多。
　　在小鼠HBV慢性感染模型中，CXCR3+CXCR6+γδ T細胞的比例略有下降，分泌IFN-γ量增多，IL-17的量不變，同時CXCR3+CXCR6+γδ T細胞表面的活化性受體CD69表達增加，抑制性受體PD-1、LAG-3和CTLA4的表達基本不變。
　　二、 HBV感染時轉(zhuǎn)錄因子對免疫細胞受體及配體表達調(diào)控的研究
　　1.HBV慢性感染導(dǎo)致T細胞表面抑制性分子表達升高

26、>　　HBV慢性感染小鼠肝臟和脾臟中CD4+和CD8+T細胞表面的抑制性分子BTLA、CD160、Tim-3、CTLA4、PD-1和LAG-3表達均高于正常小鼠，尤其是肝臟中的CD8+T細胞更為明顯，說明HBV慢性感染可加重肝臟的免疫抑制狀態(tài)。
　　2.Eomes與CD8+T細胞表面抑制性分子的表達呈正相關(guān)
　　HBV慢性感染小鼠肝臟中Eomes+的CD8+T細胞表達抑制性分子BTLA、CD160、Tim-3、CTLA4、P

27、D-1和LAG-3的水平高于Eomes-的CD8+T細胞。HBV慢性感染的WT鼠肝臟中CD8+T細胞表面制性分子的表達高于EKO小鼠。這些結(jié)果說明Eomes可促進CD8+T細胞表現(xiàn)抑制性分子的表達。
　　3.WT小鼠肝臟HBV特異性CD8+T細胞抑制性分子的表達高于EKO小鼠
　　小鼠肝臟中Eomes+的HBV特異性CD8+T細胞表面抑制性分子PD-1、Tim-3、CD160和LAG-3的表達水平高于Eomes-的HBV特異

28、性CD8+T細胞;WT鼠肝臟中HBV特異性CD8+T細胞表面抑制性分子的表達水平也高于EKO鼠。餅圖分析結(jié)果提示Eomes可促進HBV特異性CD8+T細胞表面抑制性分子的共表達。
　　4.WT和EKO小鼠肝臟HBV特異性CD8+T效應(yīng)功能無明顯區(qū)別
　　WT鼠HBV特異性CD8+T細胞分泌的IL-2、TNF-α和IFN-γ水平與EKO小鼠沒有區(qū)別，說明Eomes不影響CD8+T細胞分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ等細胞因

29、子的能力。
　　5.Eomes缺失可促使HBV病毒的快速清除
　　WT鼠尾靜脈高壓注射HBV質(zhì)粒后血清中HBs抗原、HBe抗原水平、HBVDNA的載量和肝臟中HBcAg的含量均高于EKO鼠，表明小鼠缺失Eomes分子后，清除HBV病毒的能力更強。
　　6.Eomes可直接與CD160啟動子結(jié)合進而促進CD160的表達
　　WT小鼠肝臟淋巴細胞NFATc1、Blimp-1和FoxO1的表達水平均高于EKO小鼠，染色

30、質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄因子Eomes可直接與抑制性分子CD160啟動子序列結(jié)合，直接調(diào)控其表達。
　　7.HBV陽性肝癌細胞表面NKG2D配體的表達低于HBV陰性肝癌細胞
　　Q-PCR和流式結(jié)果顯示HepG2.2.15和HepG2-HBV細胞表面NKG2D的配體MICA、MICB和ULBP1，2，3的表達低于HepG2和HepG2-N1細胞，NK細胞對HepG2-HBV和HepG2.2.15細胞的殺傷活性明顯低于HepG

31、2細胞，MICA/B和NKG2D阻斷抗體可進一步降低NK細胞對肝癌細胞的殺傷。
　　8.HBx基因和HBc基因明顯下調(diào)HepG2細胞表面NKG2D配體
　　流式細胞術(shù)和Westem Blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染HBx和HBc基因后，HepG2細胞表面的MICA表達明顯降低。HepG2-X和HepG2-C細胞對NK細胞殺傷敏感性明顯低于HepG2-N1細胞，MICA/B和NKG2D阻斷抗體可進一步降低肝癌細胞對NK細胞的殺傷敏感性。<

32、br>　　9.GATA-2和GATA-3抑制肝癌表面MICA的表達
　　經(jīng)網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)MCA啟動子上含有轉(zhuǎn)錄因子GATA-2和GATA-3的結(jié)合位點，HepG2.2.15細胞中沉默GATA-2和GATA-3表達后，MICA的表達增加。
　　10.HBx和GATA-2/GATA-3共同抑制MICA的表達
　　染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示GATA-2和GATA-3可以直接結(jié)合在MICA啟動子上，沉默HBx基因后，GATA-2和

33、GATA-3與MICA啟動子的結(jié)合降低。免疫共沉淀實驗證明GATA-2、GATA-3和HBx蛋白可以形成三聚體。
　　11.HBc核心蛋白可直接與MICA啟動子的CpG島結(jié)合抑制MICA的表達
　　染色質(zhì)免疫共沉淀顯示HBc蛋白可直接與MICA和MICB啟動子上的CpG島結(jié)合，而HBc蛋白不能與GATA-2和GATA-3形成三聚體。
　　結(jié)論及意義:
　　1.本研究通過比較小鼠肝臟、脾臟、胸腺和小腸上皮內(nèi)γδ T

34、細胞的表型差異，首次發(fā)現(xiàn)了一群僅存在于肝臟中的CXCR3+CXCR6+γδ T細胞亞群，并且這群細胞具有肝臟駐留的特性。在小鼠HBV急性感染模型模型中，過繼轉(zhuǎn)輸CXCR3+CXCR6+γδ T細胞可抵抗HBV急性感染;在HBV慢性感染模型中，CXCR3+CXCR6+γδ T細胞產(chǎn)生更多的IFN-γ并高表達CD69，細胞處于活化狀態(tài)，提示我們這群細胞可能不參與維持肝臟免疫耐受，但發(fā)揮的具體作用還不清楚，還需進一步驗證。
　　2.我們

35、首次發(fā)現(xiàn)HBV慢性感染時轉(zhuǎn)錄因子Eomes可促進CD8+T細胞表面抑制性受體的表達、促進T細胞耗竭和HBV免疫逃逸;轉(zhuǎn)錄因子GATA-2和GATA-3可與HBx蛋白結(jié)合形成三聚體進而抑制肝癌細胞NKG2D配體MICA的表達，削弱HBV感染的肝癌細胞對NK細胞的殺傷敏感性，促使HBV感染的肝癌細胞逃逸NK細胞的殺傷。此結(jié)果不僅揭示了HBV通過轉(zhuǎn)錄因子Eomes、GATA-2和GATA-3調(diào)節(jié)免疫細胞受體或配體的表達逃逸免疫細胞攻擊的機制，