激酶類抑制劑對紫杉醇羥化途徑的選擇性抑制以及藥物相互作用研究.pdf

1、目的：
　　紫杉醇在臨床上常與小分子激酶類抑制劑聯(lián)用以增強抗腫瘤效果，而大多數激酶類抑制劑對代謝酶有抑制作用，可能引起藥物之間的相互作用。本文以此為研究背景，考察12個小分子激酶類抑制劑在體外人肝微粒體中，對CYP2C8和CYP3A4介導的紫杉醇羥基化代謝途徑的抑制，并鑒別激酶類抑制劑對紫杉醇羥化代謝途徑的抑制選擇性。通過分子對接和光譜分析模擬激酶類抑制劑與酶蛋白的結合，應用數學模型預測藥物相互作用的機制與程度。
　　方法：

2、
　　首先建立同時檢測紫杉醇兩個代謝物6α-羥基紫杉醇和p-3’羥基紫杉醇的LC-MS/MS定量分析方法；建立并優(yōu)化紫杉醇在體外人肝微粒體中代謝孵育體系，并同時監(jiān)測激酶類抑制劑對紫杉醇兩條代謝途徑的抑制作用，獲得12個激酶類抑制劑對CYP2C8和CYP3A4代謝途徑的可逆性抑制參數Ki，以及阿西替尼時間依賴性抑制常數KI和 kinact。通過使用谷胱甘肽捕獲阿西替尼氧化反應的中間體，以超高效液相色譜–紫外–四級桿飛行時間質譜法（U

3、PLC-UV/Q-TOF MS）檢測反應體系中谷胱甘肽加合物。使用分子對接模型模擬抑制劑與酶蛋白的結合，獲得對接Glide分值，考察該分值與抑制實驗中獲得的抑制常數Ki的相關性。通過P450吸收光譜分析，考察抑制劑與酶蛋白結合類型，分析抑制劑與酶蛋白結合緊密程度與其抑制常數之間的相關性。以抑制常數和紫杉醇體內外代謝份數為主要參數，運用數學模型預測紫杉醇與激酶類抑制劑聯(lián)用時的藥物相互作用程度。
　　結果：
　　12個小分子激酶

4、類抑制劑對紫杉醇羥基化代謝有不同程度的抑制作用，其中尼洛替尼對CYP2C8和CYP3A4代謝途徑均有較強的可逆性抑制作用，Ki值分別為0.1和0.28μM。阿西替尼，拉帕替尼，尼洛替尼和索拉非尼選擇性地抑制CYP2C8介導的紫杉醇的羥基化代謝；而博舒替尼，達沙替尼，厄洛替尼，帕唑帕尼和舒尼替尼選擇性地抑制CYP3A4介導的紫杉醇的羥基化代謝。阿法替尼，吉非替尼和伊馬替尼對紫杉醇兩條羥基化代謝抑制強度相當。此外，阿法替尼，厄洛替尼，吉非替

5、尼，拉帕替尼和索拉非尼對CYP2C8代謝途徑有中等程度的時間依賴性抑制作用，而除索拉非尼以外的其他激酶類抑制劑對CYP3A4代謝途徑有較強的時間依賴性抑制作用。阿西替尼對CYP3A4酶介導的紫杉醇羥基化代謝途徑有較強的時間依賴性抑制作用，動力學參數KI和kinact分別為0.93μM和0.0137 min-1。用捕獲劑GSH捕獲到阿西替尼氧化中間體，說明氧化活化是產生時間依賴性抑制的原因。分子對接模擬分析發(fā)現，尼洛替尼可通過多個氫鍵和范

6、德華作用力與酶蛋白氨基酸殘基緊密結合，而舒尼替尼與酶蛋白氨基酸殘基的作用力相對較弱。實驗獲得的CYP3A4 Glide對接分值與抑制實驗獲得的Ki值有較好的線性相關性（r2=0.64），而CYP2C8 Glide對接分值與抑制實驗獲得的Ki值線性相關性較弱（r2=0.51）。光譜分析實驗結果顯示，大多數具有較強酶抑制作用的激酶類抑制劑與CYP2C8和CYP3A4的結合表現為II型光譜。與此結果相比較，盡管博舒替尼作為CYP2C8的強抑制

7、劑，但其與CYP2C8的結合并未表現為II型光譜。光譜實驗獲得的抑制劑與CYP2C8（r2=0.950）和CYP3A4（r2=0.807）酶光譜解離常數Ks和可逆性抑制參數Ki有較好的線性相關性。數學模型模擬預測藥物相互作用結果顯示，紫杉醇肝攝取率的引入大大提高了預測結果的準確性。相反，時間依賴性抑制參數的引入會高估紫杉醇與激酶類抑制劑的藥物相互作用，該高估現象與紫杉醇CYP3A4代謝途徑的代謝份數相關。
　　結論：
　　本

8、課題研究發(fā)現激酶類抑制劑對紫杉醇羥化代謝途徑的抑制有選擇性，并且大部分激酶類抑制劑對CYP3A4介導的代謝有時間依賴性抑制作用。分子對接模型模擬顯示尼洛替尼分子與CYP2C8和CYP3A4酶蛋白氨基酸殘基有較強的結合作用，該結果與體外抑制實驗數據一致。光譜分析顯示大部分激酶類抑制劑與酶蛋白結合表現為II型光譜。數學模型模擬預測顯示紫杉醇肝攝取率的引入大大提高了預測結果的準確性。
　　本研究系統(tǒng)地考察了12種激酶類抑制劑對紫杉醇代謝