多尺度圖式化結(jié)構(gòu)中HepG2細(xì)胞功能表型及分析方法研究.pdf

1、肝臟是人體新陳代謝和藥物轉(zhuǎn)化的重要器官，基于肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)細(xì)胞微系統(tǒng)或生物人工肝在醫(yī)療領(lǐng)域和藥物篩選平臺(tái)構(gòu)建方面具有重要的研究意義和實(shí)用價(jià)值。細(xì)胞體外培養(yǎng)的核心目標(biāo)在于保持其近似于體內(nèi)狀態(tài)的活度與功能，在體肝細(xì)胞作為一種高度特化的極性細(xì)胞，其細(xì)胞之間的緊密連接將肝細(xì)胞頂端膜和基底側(cè)膜隔開，同時(shí)維持了肝細(xì)胞的“立方”（cuboidal）形態(tài)特征，而這種形態(tài)特征與肝細(xì)胞的功能表型維持密切相關(guān)。因此，以何種結(jié)構(gòu)基底設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞極性或形態(tài)特

2、征的維持是有關(guān)細(xì)胞平臺(tái)構(gòu)建的核心問題之一。此外，肝細(xì)胞體外培養(yǎng)微系統(tǒng)的檢驗(yàn)與應(yīng)用在于細(xì)胞活力和功能表型評(píng)價(jià)，較為直接的方法是采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)蛋白、基因表達(dá)或代謝產(chǎn)物的檢測(cè)分析，而相關(guān)方法通常不適于快速檢測(cè)以及對(duì)待測(cè)樣品的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，特別是在一些體積小，設(shè)計(jì)復(fù)雜的細(xì)胞微系統(tǒng)或微流控芯片中，難以獲得足夠的檢測(cè)樣本以供相應(yīng)的分子生物學(xué)技術(shù)分析。設(shè)計(jì)合理、有效的可視化細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)分析方法將有助于彌補(bǔ)這些缺陷，并能夠成為細(xì)胞微系統(tǒng)在藥物篩選等領(lǐng)

3、域的參考指標(biāo)。
　　本研究基于以亞細(xì)胞尺度圖式化結(jié)構(gòu)支撐HepG2細(xì)胞“立方”形態(tài)的設(shè)計(jì)思路，依據(jù)肝細(xì)胞尺寸特征構(gòu)建了微柱直徑為4、10μm，微柱間距為4、7μm，微柱高度為4μm的4種微柱陣列圖式化結(jié)構(gòu)；基于以多細(xì)胞尺度圖式化結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)HepG2細(xì)胞聚集體培養(yǎng)而維持細(xì)胞連接和極性的設(shè)計(jì)思路，依據(jù)HepG2聚集體尺寸特征構(gòu)建了內(nèi)徑100μm，深度100μm，無通道和含20μm、40μm通道的3種凹形圖式化結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，考察了圖式

4、化結(jié)構(gòu)尺寸設(shè)計(jì)對(duì)HepG2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。本文改進(jìn)了基于TMRM（tetramethylrhodamine methyl ester）電勢(shì)熒光染料的細(xì)胞靜息膜電位（resting membrane potential，RMP）檢測(cè)方法，提高了其準(zhǔn)確性和適用性，并以之評(píng)價(jià)了圖式化結(jié)構(gòu)中HepG2細(xì)胞RMP與生長(zhǎng)狀態(tài)和極性的關(guān)系，提出以該方法分析體外微系統(tǒng)中細(xì)胞狀態(tài)的可行性。相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有助于豐富細(xì)胞力學(xué)響應(yīng)、電生理響應(yīng)的相關(guān)知識(shí)，并

5、對(duì)于生物人工肝或體外細(xì)胞微系統(tǒng)的設(shè)計(jì)、構(gòu)建及評(píng)價(jià)分析具有一定的參考意義。本文的主要內(nèi)容和結(jié)果：
　　建立亞細(xì)胞尺度微柱陣列圖式化結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)上微柱面積覆蓋率（percentage of pillared area，PPA）及微柱直徑和間距尺寸影響HepG2細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生以及粘著斑和細(xì)胞骨架裝配，HepG2細(xì)胞功能基因表達(dá)與細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征密切相關(guān)。具體表現(xiàn)為：PPA和微柱直徑較大的結(jié)構(gòu)上易于形成“立方”細(xì)胞，其白蛋白和CYP（cyt

6、ochrome P450）表達(dá)均較高；微柱直徑較小，間距較大（PPA較?。┑慕Y(jié)構(gòu)上易于形成與平面基底相似的“扁平”狀細(xì)胞，功能基因表達(dá)較低；微柱直徑、間距均較小的結(jié)構(gòu)上易于形成“梭形”細(xì)胞，伴隨CYP基因的高表達(dá)。細(xì)胞增殖活力與微柱陣列圖式化結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)無顯著關(guān)系，粘著斑的數(shù)量和面積與PPA成負(fù)相關(guān)趨勢(shì)。提示合理的亞細(xì)胞尺度圖式化結(jié)構(gòu)有助于細(xì)胞形態(tài)的維持和功能表型的改善。
　　構(gòu)建多細(xì)胞尺度的凹形圖式化結(jié)構(gòu)，在上面HepG2細(xì)胞成聚集

7、體方式生長(zhǎng)，其白蛋白和CYP基因表達(dá)較常態(tài)二維培養(yǎng)顯著提高。微小凹之間含通道的圖式化結(jié)構(gòu)較無通道組HepG2細(xì)胞功能基因表達(dá)無顯著性差異，但通道設(shè)計(jì)有助于減少細(xì)胞凋亡。凹形圖式化結(jié)構(gòu)中細(xì)胞增殖活力隨培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)而降低，與通道設(shè)計(jì)無顯著相關(guān)性。
　　對(duì)上述兩類圖式化結(jié)構(gòu)中HepG2細(xì)胞EMT（epithelial-mesenchymal transition）行為研究發(fā)現(xiàn)，凹形圖式化結(jié)構(gòu)上或其它結(jié)構(gòu)上成聚集體狀態(tài)的細(xì)胞 E-鈣黏素集

8、中分布于細(xì)胞邊緣，平面基底或微柱陣列圖式化結(jié)構(gòu)上的鋪展細(xì)胞E-鈣黏素分布較彌散，提示后者具有不同程度的EMT傾向，進(jìn)一步檢測(cè)EMT相關(guān)特征基因（α-SMA，vimentin，E-cadherin）的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，兩類圖式化結(jié)構(gòu)和平面基底上細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)均無明顯差異。暗示HepG2細(xì)胞在本研究中的培養(yǎng)條件下未發(fā)生完全的EMT行為。
　　以激光共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞外溶液和細(xì)胞內(nèi)TMRM進(jìn)行層掃分析，發(fā)現(xiàn)聚焦層面TMRM熒光強(qiáng)度會(huì)受到相鄰層

9、面的干擾，并依此改進(jìn)了TMRM熒光強(qiáng)度取值方法；依據(jù)細(xì)胞內(nèi)外離子分布特性建立了不依賴于“零電位”的細(xì)胞內(nèi)TMRM非電勢(shì)依賴結(jié)合測(cè)算方法。以TMRM測(cè)算細(xì)胞RMP方法的改進(jìn)不僅提高了檢測(cè)精度，也使之適用于三維培養(yǎng)細(xì)胞RMP的檢測(cè)。已上述方法測(cè)算了不同圖式化結(jié)構(gòu)上HepG2細(xì)胞RMP，發(fā)現(xiàn)微柱陣列圖式化結(jié)構(gòu)上細(xì)胞RMP與平面基底無顯著性差異；凹形圖式化結(jié)構(gòu)中HepG2細(xì)胞RMP顯著低于平面基底。對(duì)凹形圖示化結(jié)構(gòu)細(xì)胞RMP頻度分析發(fā)現(xiàn)，去極化