BCG-CPG-DNA佐劑的作用機(jī)理研究與評價(jià).pdf

1、疫苗佐劑能夠非特異性提高機(jī)體對抗原的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，在疫苗的接種免疫過程中發(fā)揮輔助作用:同疫苗一起使用，能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生長期、高效的特異性免疫反應(yīng)，提高機(jī)體保護(hù)能力，降低疫苗的免疫用量，降低疫苗成本、減少疫苗所引發(fā)的不良反應(yīng)。近年來，為適應(yīng)新型疫苗的需求，佐劑已經(jīng)從傳統(tǒng)、單一的形式向新型、多元化形式發(fā)展，尤其用于黏膜疫苗、DNA疫苗及腫瘤疫苗的佐劑研究成為熱點(diǎn)。其中CPG寡核苷酸(CPG ODN)是目前研究的熱點(diǎn)，細(xì)菌DNA中含有大量非甲

2、基化CPG基序，因此細(xì)菌DNA和CPG ODN統(tǒng)稱為CPG DNA。BCG-CPG-DNA是從減毒牛型分枝桿菌卡介苗中提取的基因組DNA片段，分子量大于1Kbp，富含未甲基化的CPG基序，純度高、質(zhì)量可控。
　　本研究通過應(yīng)用BCG-CPG-DNA佐劑作用于小鼠后，觀察注射后不同時(shí)間點(diǎn)脾臟內(nèi)淋巴細(xì)胞比例變化、血清中細(xì)胞因子的變化、和注射部位免疫細(xì)胞的募集情況來分析探索BCG-CPG-DNA佐劑的作用機(jī)理，通過與鋁佐劑及復(fù)合佐劑BC

3、02的比較對其佐劑效應(yīng)特點(diǎn)做出初步評價(jià)。
　　一、小鼠脾臟淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞分型
　　本研究通過對比不同佐劑作用于小鼠后不同時(shí)間點(diǎn)脾臟淋巴結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞比例的變化來探索BCG-CPG-DNA佐劑的作用機(jī)理和評價(jià)其佐劑效應(yīng)特點(diǎn)。用PBS作為機(jī)理探索對照，用鋁佐劑和復(fù)合佐劑BC02作為評價(jià)對照，分別于注射后6h、12h、24h、48 h、72 h和96 h無菌獲取脾臟內(nèi)淋巴細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測脾臟內(nèi)淋巴細(xì)胞比例。結(jié)果顯示:BCG-C

4、PG-DNA進(jìn)入機(jī)體后能同時(shí)促進(jìn)B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的活化、增殖和分化，介導(dǎo)機(jī)體內(nèi)Th1免疫應(yīng)答和Th2免疫應(yīng)答。同鋁佐劑復(fù)合使用，比兩者單獨(dú)使用對體內(nèi)免疫應(yīng)答有更強(qiáng)的介導(dǎo)作用。
　　二、小鼠注射部位免疫細(xì)胞募集
　　本研究通過對不同佐劑作用于小鼠后不同時(shí)間點(diǎn)注射部位肌肉組織中免疫細(xì)胞的募集情況來探索BCG-CPG-DNA佐劑的作用機(jī)理和評價(jià)其佐劑效應(yīng)特點(diǎn)。用PBS作為機(jī)理探索對照，用鋁佐劑和復(fù)合佐劑BC02作為評價(jià)對照，

5、分別于注射后24 h、48 h、72 h和96 h獲取注射部位肌肉組織，冰凍切片，經(jīng)MHC-Ⅱ類分子特異性熒光染色、HE染色觀察注射部位免疫細(xì)胞募集情況和炎性細(xì)胞浸潤情況。結(jié)果顯示:BCG-CPG-DNA進(jìn)入機(jī)體后能引起注射部位肌肉組織炎性細(xì)胞浸潤，并能夠在注射部位募集DC等免疫細(xì)胞，促進(jìn)抗原提呈和機(jī)體內(nèi)免疫應(yīng)答過程;對免疫細(xì)胞的募集速度大于鋁佐劑但對免疫細(xì)胞的募集能力低于鋁佐劑，同鋁佐劑復(fù)合使用，有更強(qiáng)更迅速的免疫細(xì)胞募集能力。

6、>　　三、小鼠血清細(xì)胞因子的檢測
　　本研究通過對不同佐劑作用于小鼠后不同時(shí)間點(diǎn)血清中細(xì)胞因子濃度的變化來探索BCG-CPG-DNA佐劑的作用機(jī)理和評價(jià)其佐劑效應(yīng)特點(diǎn)。用未處理的小鼠血清細(xì)胞因子濃度作為正常值參考，用PBS作為機(jī)理探索對照，用鋁佐劑和復(fù)合佐劑BC02作為評價(jià)對照，分別于注射后6h、12h、24 h、48 h、72 h和96 h收集血清，用多因子試劑盒檢測細(xì)胞因子IL-17、IL2、IL-5、IL-6、IL-10、I

7、FN-γ、TNF-α、G-CSF、IP-10和MCP-1濃度。結(jié)果顯示:BCG-CPG-DNA進(jìn)入機(jī)體后能明顯促進(jìn)和刺激血液中各種細(xì)胞因子濃度水平的升高;相比于鋁佐劑，BCG-CPG-DNA進(jìn)入機(jī)體短時(shí)間內(nèi)即可刺激機(jī)體產(chǎn)生高濃度水平的細(xì)胞因子，作用更加迅速和及時(shí);同鋁佐劑復(fù)合使用，比兩者單獨(dú)使用對血清細(xì)胞因子的產(chǎn)生有更強(qiáng)的促進(jìn)作用。
　　四、結(jié)論
　　BCG-CPG-DNA佐劑作用于機(jī)體能引起注射部位以DC為主的免疫細(xì)胞的募