以PCR為基礎(chǔ)的BCG菌株基因分型及BCG DNA中CpG含量的測定.pdf

1、目的：對目前國內(nèi)卡介苗（BCG）生產(chǎn)用株進(jìn)行基因分型，檢測BCG DNA中胞嘧啶-鳥嘌呤（CpG）的含量。 方法：收集菌體分別經(jīng)機(jī)械破碎或溶菌處理，用溴化十六烷基三甲基銨（CTAB）進(jìn)行沉淀，再經(jīng)酚：氯仿：異戊醇抽提，對所得DNA進(jìn)行紫外掃描、凝膠電泳檢測。主要采用PCR技術(shù)對11種BCG菌株及對比株提取的DNA進(jìn)行體外擴(kuò)增,引物針對BCG菌株某些特異性缺失及擴(kuò)增染色體片段而設(shè)計(jì)，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增情況，并對所得產(chǎn)物進(jìn)行

2、測序鑒定。以CpG特異的甲基化酶（CpG Methylase）M.SssI對BCG DNA進(jìn)行修飾，將CpG中的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶（MC），利用限制性內(nèi)切酶HpaⅡ進(jìn)行消化以檢測甲基化程度，甲基化完全的DNA經(jīng)相關(guān)酶水解后應(yīng)用反相高效液相色譜（RP-HPLC）方法檢測樣品中CpG的質(zhì)量百分含量。 結(jié)果：機(jī)械破碎抽提BCG DNA產(chǎn)率高、純度高，溶菌處理抽提DNA完整性好。在BCG相關(guān)片段的PCR擴(kuò)增中，國內(nèi)BCG生

3、產(chǎn)用株均顯示相同PCR結(jié)果，SenX3-regX3擴(kuò)增片段為353 bp，RD Denmark/Glaxo擴(kuò)增產(chǎn)物分別為281 bp（AL/AR）、1637 bp（BL/BR），nRD18擴(kuò)增產(chǎn)物分別為655 bp（AL/AR）、406 bp（L/R/wtR），IS6110 copyⅡ擴(kuò)增產(chǎn)物417 bp，RD2及nRD18（AL/CR）擴(kuò)增無產(chǎn)物。BCG 上海新菌種DNA樣品的CpG質(zhì)量百分含量為23.61％，巴斯德株抽提DNA樣品的

4、CpG質(zhì)量百分含量為23.53％。 結(jié)論：CTAB沉淀是一種比較簡便易行的BCG DNA提取方法。國內(nèi)BCG生產(chǎn)用株均顯示相同基因型，特異性缺失RD2，nRD18和RD Denmark/Glaxo均存在，IS6110為單拷貝，senX3-regX3基因間區(qū)域的77-bp分枝桿菌散在分布重復(fù)單位（MIRUs）為三重拷貝。在目前具有代表性的國際公認(rèn)菌株中未能找到與國內(nèi)株基因型匹配者。采用甲基化特異酶修飾、酶水解、RP-HPLC的方法