褐藻多糖對(duì)M2型巨噬細(xì)胞CCL22表達(dá)的影響與機(jī)制研究及外周血粒淋比作為腫瘤預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響因素分析.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行了論述：
　　第一部分 褐藻多糖對(duì)M2型巨噬細(xì)胞CCL22表達(dá)的影響與機(jī)制研究
　　一、褐藻多糖對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響
　　目的:
　　探討褐藻多糖對(duì)巨噬細(xì)胞極化方向及極化過(guò)程中不同亞型標(biāo)志性細(xì)胞因子表達(dá)的影響。
　　方法:
　　采用THP-1單核細(xì)胞系，對(duì)其分別向M0（未極化狀態(tài)）、M1和M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo);在不同誘導(dǎo)過(guò)程中分別進(jìn)行褐藻多糖處理，顯微鏡觀察誘導(dǎo)48 h后巨噬細(xì)胞形態(tài)

2、學(xué)變化;實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative real-time polymerase chainreaction，qRT-PCR)檢測(cè)褐藻多糖對(duì)不同亞型標(biāo)志因子表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.褐藻多糖對(duì)不同極化方向的巨噬細(xì)胞形態(tài)無(wú)顯著影響;
　　2.針對(duì)M1型細(xì)胞因子，褐藻多糖可顯著下調(diào)TNF-α在M1型巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中的表達(dá);
　　3.針對(duì)M2型細(xì)胞因子，褐藻多糖可顯著下調(diào)TGF-β在M2型巨噬細(xì)胞極

3、化過(guò)程中的表達(dá)。
　　小結(jié):
　　在巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中，褐藻多糖可抑制部分M1和M2型特異細(xì)胞因子的表達(dá)，但對(duì)THP-1來(lái)源的巨噬細(xì)胞向M1或M2方向的極化無(wú)顯著影響。
　　二、褐藻多糖對(duì)巨噬細(xì)胞CC類趨化因子表達(dá)的影響
　　目的:
　　研究褐藻多糖對(duì)巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中CC類趨化因子的調(diào)控作用;探討CCL22在M2型巨噬細(xì)胞中高表達(dá)的誘導(dǎo)因素及褐藻多糖的調(diào)控作用。
　　方法:
　　1.qRT-P

4、CR檢測(cè)THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中褐藻多糖對(duì)多種巨噬細(xì)胞相關(guān)CC類趨化因子轉(zhuǎn)錄水平的影響;
　　2.從變化顯著的M2型相關(guān)趨化因子CCL22著手，利用THP-1來(lái)源的M2型巨噬細(xì)胞模型，采用qRT-PCR和ELISA檢測(cè)技術(shù)，研究M2型誘導(dǎo)因子IL-4和IL-13對(duì)其高表達(dá)的差異調(diào)控，以及褐藻多糖對(duì)M2型巨噬細(xì)胞CCL22表達(dá)和分泌水平的影響;
　　3.采用Ficol密度梯度分離法和CD14磁珠分選技術(shù)，分離人外周血中

5、的單核細(xì)胞并誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，進(jìn)一步驗(yàn)證褐藻多糖對(duì)CCL22的調(diào)控作用。
　　結(jié)果:
　　1.CC類趨化因子家族中，CCL2和CCL22分別作為M1和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志性趨化因子，在THP-1來(lái)源的M1或M2型巨噬細(xì)胞中高表達(dá);
　　2.褐藻多糖可下調(diào)部分巨噬細(xì)胞相關(guān)趨化因子的轉(zhuǎn)錄水平，對(duì)M2型巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中CCL22的抑制作用尤為顯著;
　　3.M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)因子IL-4對(duì)極化后M2型巨噬細(xì)胞高表達(dá)C

6、CL22起主要作用，IL-13起協(xié)同作用，而褐藻多糖起顯著抑制作用;
　　4.人外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞中，CCL22的高表達(dá)和胞外分泌水平同樣受到褐藻多糖的顯著抑制。
　　小結(jié):
　　褐藻多糖可顯著抑制IL-4&IL-13誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞中CCL22的高表達(dá)并降低其胞外分泌水平。
　　三、褐藻多糖通過(guò)CCL22調(diào)節(jié)M2型巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤和淋巴細(xì)胞的趨化作用
　　目的:
　　基于趨化因子C

7、CL22在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮的重要作用，探究褐藻多糖對(duì)M2型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞及不同亞型T淋巴細(xì)胞募集作用的影響。
　　方法:
　　1.選用MHCC-97H人肝癌細(xì)胞系，采用Transwell小室檢測(cè)褐藻多糖作用的M2型巨噬細(xì)胞上清對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移的影響;并通過(guò)CCL22中和抗體和重組蛋白驗(yàn)證該影響與CCL22水平的相關(guān)性;
　　2.利用Transwell小室和流式檢測(cè)技術(shù)分析褐藻多糖作用后的M2型巨噬細(xì)胞上清對(duì)人外周

8、血來(lái)源單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中不同類型（CD4+和CD4-）T淋巴細(xì)胞的募集作用;
　　3.采用磁珠分選技術(shù)，分離CD4+T淋巴細(xì)胞建立細(xì)胞遷移模型，流式分析技術(shù)檢測(cè)不同條件上清募集的細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+ Treg細(xì)胞所占的比例，驗(yàn)證與褐藻多糖對(duì)CCL22表達(dá)調(diào)控的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.褐藻多糖或CCL22中和抗體預(yù)處理顯著抑制

9、M2型巨噬細(xì)胞上清對(duì)MHCC-97H細(xì)胞的遷移作用，加入外源性CCL22可在一定程度上恢復(fù)細(xì)胞遷移;
　　2.與正常M2型巨噬細(xì)胞上清相比，褐藻多糖預(yù)處理細(xì)胞的上清對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞的募集比例和數(shù)量明顯下調(diào);
　　3.對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，褐藻多糖預(yù)處理后M2型巨噬細(xì)胞上清對(duì)Treg細(xì)胞的募集作用顯著降低，并且與上清中CCL22的水平相關(guān)。
　　小結(jié):
　　通過(guò)抑制M2型巨噬細(xì)胞CCL22的表達(dá)、

10、降低胞外分泌水平，褐藻多糖可顯著抑制M2型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤遷移和CD4+T淋巴細(xì)胞特別是Treg細(xì)胞的募集作用。
　　四、褐藻多糖下調(diào)M2型巨噬細(xì)胞CCL22的機(jī)制研究
　　目的:
　　探討褐藻多糖對(duì)M2型巨噬細(xì)胞中CCL22下調(diào)作用的胞內(nèi)調(diào)控機(jī)制。
　　方法:
　　1.Western Blot檢測(cè)褐藻多糖對(duì)THP-1來(lái)源M2型巨噬細(xì)胞中AKT、p38-MAPK以及p65-NF-κB磷酸化水平的影響;

11、r>　　2.采用相關(guān)通路抑制劑進(jìn)行預(yù)處理，通過(guò)qRT-PCR和ELISA檢測(cè)阻斷特異信號(hào)通路對(duì)CCL22表達(dá)和分泌水平的影響;
　　3.采用免疫熒光檢測(cè)p65-NF-κB核轉(zhuǎn)運(yùn)，驗(yàn)證褐藻多糖及信號(hào)通路抑制劑對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子NF-κB活性的影響。
　　結(jié)果:
　　1.褐藻多糖顯著抑制THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞中PI3K-AKT通路和p65-NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)p38-MAPK信號(hào)通路;
　　2.PI3K-AKT通路

12、抑制劑Wortmannin可顯著上調(diào)CCL22的表達(dá)和分泌水平，p38-MAPK通路抑制劑SB203580和NF-κB抑制劑BAY11-7082可顯著下調(diào)CCL22的表達(dá)和分泌水平;
　　3.抑制PI3K-AKT通路可促進(jìn)p38-MAPK的磷酸化并上調(diào)p65-NF-κB的磷酸化及核轉(zhuǎn)運(yùn)，而抑制p38-MAPK通路可抑制AKT的磷酸化并下調(diào)p65-NF-κB的磷酸化及核轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　小結(jié):
　　褐藻多糖對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子NF-

13、κB的抑制作用是下調(diào)CCL22表達(dá)和胞外分泌水平的關(guān)鍵因素。同時(shí)，CCL22表達(dá)與p38-MAPK、PI3K-AKT通路也具有一定的相關(guān)性。
　　第二部分 外周血粒淋比作為腫瘤預(yù)后指標(biāo)的影響因素分析
　　目的:
　　建立腎細(xì)胞癌患者術(shù)前外周血粒淋比的預(yù)后評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn);分析術(shù)前外周血粒淋比和腎細(xì)胞癌患者臨床參數(shù)的相關(guān)性;已建立的評(píng)價(jià)方法分別對(duì)有、無(wú)高血壓的腎細(xì)胞癌患者預(yù)后評(píng)價(jià)的差異比較;評(píng)估術(shù)前外周血粒淋比對(duì)于腎細(xì)胞癌患者預(yù)

14、后評(píng)價(jià)的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法:
　　1.研究對(duì)象:建立篩選標(biāo)準(zhǔn)，將401例腎細(xì)胞癌初治患者信息納入研究范圍。
　　2.樣本信息的提取及處理:對(duì)患者病例基本信息、病理信息、外周血檢驗(yàn)報(bào)告信息和隨訪信息進(jìn)行歸納總結(jié)。
　　3.外周血粒淋比截?cái)嘀档墨@取:將粒淋比指標(biāo)、隨訪信息帶入截?cái)嘀捣治銎脚_(tái)，以時(shí)序檢驗(yàn)（log-rank test）、ROC曲線和Cox回歸模型為分析基礎(chǔ)，計(jì)算與無(wú)復(fù)發(fā)生存期具有相關(guān)性的粒淋比最優(yōu)截?cái)嘀?/p>

15、。
　　結(jié)果:
　　1.研究樣本包含男性276例、女性125例，平均年齡54歲。有高血壓病史患者175例，占43.64％。平均隨訪時(shí)間45.5個(gè)月，其中復(fù)發(fā)患者106例，占26.43％，復(fù)發(fā)平均隨訪時(shí)間為26.4個(gè)月。
　　2.粒淋比最佳分析截?cái)嘀禐?.139。低粒淋比組患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存期顯著高于高粒淋比組。單因素及多因素分析表明，腫瘤大小、T分期、腫瘤組織學(xué)分型、粒淋比值可作為腎細(xì)胞癌患者獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，用于評(píng)價(jià)患者的

16、無(wú)復(fù)發(fā)生存期。
　　3.粒淋比和患者的腎細(xì)胞癌組織學(xué)分型、腫瘤大小、T、N、M分期、Fuhrman核分級(jí)、血小板計(jì)數(shù)有顯著相關(guān)性。粒淋比和有、無(wú)高血壓病史無(wú)顯著相關(guān)性。有、無(wú)高血壓病史組的粒淋比值無(wú)顯著性差異。
　　4.對(duì)無(wú)高血壓患者進(jìn)行分析，低粒淋比組患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存期仍顯著高于高粒淋比組。單因素和多因素分析表明T分期、腫瘤組織學(xué)分型、粒淋比和血小板數(shù)可作為無(wú)高血壓腎細(xì)胞癌患者獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，用于評(píng)價(jià)患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存期。

17、r>　　5.對(duì)有高血壓病史患者進(jìn)行分析，結(jié)果顯示高、低粒淋比組患者無(wú)復(fù)發(fā)生存期無(wú)顯著差異。單因素和多因素分析顯示臨床T、M分期、腫瘤組織學(xué)分型可作為高血壓病史腎細(xì)胞癌患者的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。而粒淋比不能作為獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)評(píng)價(jià)有高血壓病史的腎細(xì)胞癌患者預(yù)后。
　　結(jié)論:
　　通過(guò)本研究證實(shí)采用腫瘤相關(guān)因素評(píng)價(jià)預(yù)后受病理生理學(xué)指標(biāo)的干擾較小。粒淋比作為預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)之前，應(yīng)當(dāng)考慮患者是否具有高血壓病史。粒淋比等個(gè)體相關(guān)因素納入臨床預(yù)后評(píng)