真核起始因子6(eIF6)對M2型巨噬細(xì)胞纖維化相關(guān)基因影響的研究.pdf

1、在成人的深度創(chuàng)面修復(fù)的過程中，疤痕形成或纖維化產(chǎn)生是不可避免的結(jié)局，難以達(dá)到無瘢痕愈合。由于瘢痕可致軀干、四肢的形態(tài)及功能異常，引起不同程度的心理障，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，是臨床上面臨的主要問題，如何有效的控制瘢痕的增生及其相關(guān)機(jī)制研究一直是研究的熱點(diǎn)、難點(diǎn)問題之一。
　　大量的文獻(xiàn)表明，巨噬細(xì)胞作為一種免疫細(xì)胞，通過分泌某些因子，在創(chuàng)面修復(fù)及后期的纖維化發(fā)生都起到了促進(jìn)作用。巨噬細(xì)胞具有吞噬病原菌、分泌炎性因子、生長因子等發(fā)

2、揮抗炎、清除壞死組織、促進(jìn)創(chuàng)面愈合等功能。近年來通過消化的方法從人和鼠的創(chuàng)面分離巨噬細(xì)胞表明在組織修復(fù)過程中，在不同的環(huán)境刺激下，巨噬細(xì)能獲得多種表型和不同的功能。在創(chuàng)面愈合過程巨噬細(xì)胞能表達(dá)M1和M2型標(biāo)記。創(chuàng)面愈合的炎癥反應(yīng)期主要為M1巨噬細(xì)胞，主要分泌炎癥介質(zhì)發(fā)揮抗炎作用。創(chuàng)面愈合的中后期主要為M2巨噬細(xì)胞，主要分泌大量的生長因子發(fā)揮促生長作用。
　　真核起始因子6(eIF6，Eukaryotic initiation fa

3、ctor6)是一種新發(fā)現(xiàn)的能夠?qū)φ婧松锏鞍踪|(zhì)翻譯起調(diào)控作用的因子。在細(xì)胞核中，eIF6是核糖體生成不可缺少的一種因子，同時(shí)在胞漿中，eIF6與60s亞基聚合形成聚合物，發(fā)揮抗結(jié)合作用，阻止40S亞基與60S亞基結(jié)合，防止成熟的80S亞基形成。這一過程受RACK1-PKC復(fù)合物調(diào)控，40S亞基通過RACK1與PKC形成復(fù)合物，然后PKC將eIF6 Ser235磷酸化，從而將eIF6從核糖體60s亞基解聚下來，從而形成成熟的80S核糖體亞

4、基，mRNA開始翻譯組裝肽鏈。課題組前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)eIF6對皮膚創(chuàng)面的纖維化具有抑制作用。通過建立eIF6野生型與eIF6+/-兩組小鼠創(chuàng)面愈合的線性模型，結(jié)果顯示:eIF6+/-組小鼠創(chuàng)面肉芽組織增加、膠原沉積增加。同時(shí)在肝纖維化模型中，高表達(dá)eIF6組膠原沉積明顯少于對照組。
　　因此我們推測，eIF6可能影響巨噬細(xì)胞的功能進(jìn)而影響創(chuàng)面愈合。我們擬通過基因芯片技術(shù)比較eIF6野生型與eIF6+/-來源的M2巨噬細(xì)胞基因表達(dá)譜差

5、異，進(jìn)而探討eIF6影響M2巨噬細(xì)胞的哪些關(guān)鍵基因。
　　研究內(nèi)容和方法:
　　1、巨噬細(xì)胞及M2型巨噬細(xì)胞培養(yǎng)通過分離eIF6野生型與eIF6+/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)后獲得貼壁的樹枝狀細(xì)胞就是我們所需巨噬細(xì)胞。然后更換加入IL-4的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，收集細(xì)胞。
　　2、M2型巨噬細(xì)胞表型及功能鑒定用流式細(xì)胞儀檢測M2巨噬細(xì)胞的表面抗原，用RT-PCR檢測M2型巨噬細(xì)胞的精氨酸酶1（argi

6、nase-1）和TGF-β1的表達(dá)水平的表達(dá)。
　　3、基因芯片篩選差異基因?qū)⒎謩e來自eIF6野生型與eIF6+/-小鼠的M2巨噬細(xì)胞抽提RNA，干冰保存，送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司檢測。實(shí)驗(yàn)所選芯片為（Affymetrix GeneChip Mouse Gene1.0 ST Array）表達(dá)譜芯片，實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)
　　4、RT-PCR及ELISA:通過提取細(xì)胞RNA及培養(yǎng)液上清，用RT-PCR及ELISA從

7、基因RNA及蛋白水平驗(yàn)證部分感興趣的差異基因。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1、通過腹腔灌洗將巨噬細(xì)胞的分離，經(jīng)過24小時(shí)培養(yǎng)純化后，獲得貼壁的樹枝狀細(xì)胞，即為初步分離的腹腔巨噬細(xì)胞，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)F4/80和CD11b兩種巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記均為陽性，純度為94.4％。
　　2、IL-4刺激巨噬細(xì)胞24小時(shí)后，流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)，CD2O6表達(dá)明顯增強(qiáng)，而未見CD11c表達(dá)。
　　3、RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，arginase-1和

8、TGF-β1在IL-4刺激組顯著高于未刺激組。(P＜0.05)。
　　4、通過基因芯片（Affymetrix GeneChip Mouse Gene1.0 ST Array）對eIF6野生型與eIF6+/-M2巨噬細(xì)胞表達(dá)譜進(jìn)行檢測，篩選差異基因。挑選出與纖維化相關(guān)的差異基因VEGF，MMP2和TIMP2。eIF6+/-與eIF6野生型之間差異基因比值分別為:VEGF(比值1.33，p＜0.05)、MMP2（比值0.70，p＜0.

9、05）、TIMP2（比值1.54，p＜0.05）。
　　5、RT-PCR對芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證 eIF6+/-與-eIF6野生型相比，VEGF、TIMP2 RNA表達(dá)上升(P＜0.05)，MMP2表達(dá)下降(P＜0.01)，與基因芯片結(jié)果吻合
　　6、ELISA對芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證eIF6野生型與eIF6+/-相比，VEGF、 TIMP2表達(dá)明顯上升(P＜0.05)，MMP表達(dá)下降(P＜0.01)，與基因芯片結(jié)果吻合。
　　結(jié)