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文檔簡介
1、背景:真核起始因子6(Eukaryotic initiation factor6,eIF6)是一種在進(jìn)化過程中的保守蛋白,eIF6通過調(diào)控核糖體40S和60S亞基的結(jié)合在核糖體合成及翻譯調(diào)控中發(fā)揮重要作用。eIF6被認(rèn)為是翻譯起始的限速因子,可影響腫瘤發(fā)生及腫瘤生長。胞漿中eIF6活性受損可限制淋巴瘤生成及腫瘤進(jìn)展。
目的:本研究的目的是探索eIF6是否能影響肌成纖維細(xì)胞的分化?這種作用是否通過調(diào)控TGF-β1的表達(dá)實現(xiàn)?eI
2、F6又是通過什么分子機(jī)制參與TGF-β1基因的表達(dá)調(diào)控?
第一部分 eIF6基因缺陷的雜合子小鼠皮膚肌成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定
方法:
1.分離新生eIF6+/-雜合子小鼠及野生型小鼠(日齡3天內(nèi))真皮細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)(eIF6基因完全敲除的eIF6純合子小鼠胚胎在著床前即是致死性的)。本課題實驗中使用的是第1代至第3代的細(xì)胞。
2.應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測分離培養(yǎng)的真皮細(xì)胞中Vimentin及α
3、-SMA的表達(dá)。
3.應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR法對分離培養(yǎng)的真皮細(xì)胞進(jìn)行基因型鑒定,區(qū)分來自eIF6+/-雜合子小鼠及野生型小鼠的細(xì)胞。
4.應(yīng)用Real-Time PCR及Western blotting技術(shù)檢測eIF6+/-雜合子及野生型細(xì)胞中eIF6 mRNA及蛋白的表達(dá)。
結(jié)果:
1.成功分離培養(yǎng)了新生小鼠真皮肌成纖維細(xì)胞,細(xì)胞呈單層貼壁生長,呈典型的梭型及多角形形態(tài),細(xì)胞體積較大。
2
4、.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示Vimentin及α-SMA在體外培養(yǎng)的新生小鼠真皮胞漿中呈強(qiáng)陽性表達(dá),陽性細(xì)胞率為100%。
3.逆轉(zhuǎn)錄PCR實驗結(jié)果顯示,PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳僅顯示320bp一條帶的是來自于野生型小鼠的樣本,而顯示650bp及320bp兩條帶的是來自于eIF6基因表達(dá)缺陷的雜合子小鼠的樣本。
4.Western blotting實驗及Real-Time PCR實驗結(jié)果進(jìn)一步確證,與野生型小鼠真皮來源的
5、肌成纖維細(xì)胞相比, eIF6 mRNA的表達(dá)在eIF6+/-雜合子小鼠的真皮肌成纖維細(xì)胞中降低了約40%,eIF6蛋白的表達(dá)在eIF6+/-雜合子小鼠的真皮肌成纖維細(xì)胞中降低了約60%。
第二部分 eIF6對皮膚肌成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性及功能的影響
方法:
1.采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測體外培養(yǎng)的來源于野生型及eIF6+/-雜合子小鼠真皮肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期。
2.采用TUNEL法比較來源于野生型及eI
6、F6+/-雜合子小鼠真皮肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞凋亡的情況。
3.應(yīng)用Real-Time PCR及Western blotting技術(shù)檢測eIF6+/-雜合子及野生型細(xì)胞中α-SMA mRNA及蛋白的表達(dá);應(yīng)用Real-Time PCR技術(shù)檢測eIF6+/-雜合子及野生型細(xì)胞中Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá);應(yīng)用羅丹明-標(biāo)記鬼筆環(huán)肽染色eIF6+/-雜合子及野生型細(xì)胞中的應(yīng)力纖維并用激光共聚焦顯微鏡觀察應(yīng)力纖維形成的情況;應(yīng)用成纖維細(xì)胞凝膠收
7、縮模型觀察eIF6+/-雜合子及野生型細(xì)胞收縮膠原的能力。
結(jié)果:
1.采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測體外培養(yǎng)的肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期,結(jié)果顯示:來源于eIF6基因缺陷雜合子小鼠的細(xì)胞處于S期的比例明顯低于來源于野生型小鼠的細(xì)胞(eIF6+/-雜合子細(xì)胞處于S期的比例為6.92%,而野生型細(xì)胞的比例為11.16%)。然而eIF6+/-雜合子細(xì)胞處于G2/M期的比例為42.13%,顯著高于野生型細(xì)胞(僅為27.59%)。
8、 2.TUNEL法比較來源于野生型及eIF6+/-雜合子小鼠真皮肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞凋亡的情況,兩組間凋亡細(xì)胞與有核細(xì)胞比例的差異無統(tǒng)計學(xué)意義
3.較野生型細(xì)胞相比,α-SMA在eIF6+/-雜合子細(xì)胞中的表達(dá)在mRNA水平及蛋白水平均顯著增高(mRNA表達(dá)增高2.9倍,P=0.020, n=5;蛋白表達(dá)增高1.8倍,P=0.029,n=5)。eIF6+/-雜合子細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型膠原(Col1al and Col1a2) mRNA的
9、量也明顯高于野生型細(xì)胞中的表達(dá)量,Col1al mRNA表達(dá)增高4.9倍(P=0.001,n=3),Col1a2mRNA表達(dá)增高4.6倍(P=0.007,n=3)。此外,激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示:與野生型細(xì)胞相比,eIF6+/-雜合子細(xì)胞中羅丹明-標(biāo)記鬼筆環(huán)肽染色的應(yīng)力纖維形成增加,排列分布得更加密集。分析膠原收縮能力的成纖維細(xì)胞凝膠收縮模型發(fā)現(xiàn),eIF6+/-雜合子細(xì)胞收縮膠原的能力強(qiáng)于野生型細(xì)胞(P=0.001,n=3)。
10、 第三部分 eIF6對皮膚肌成纖維細(xì)胞分化過程中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響
方法:
1.應(yīng)用Real-Time PCR及Western blotting技術(shù)檢測eIF6+/-雜合子及野生型細(xì)胞中TGF-β1 mRNA及蛋白的表達(dá)。
2.應(yīng)用Real-Time PCR技術(shù)檢測eIF6+/-雜合子及野生型細(xì)胞中TGF-β1Ⅰ型受體(Tgfbr1)及TGF-β1Ⅱ型受體(Tgfbr2) mRNA的表達(dá);應(yīng)用Western b
11、lotting技術(shù)檢測在外源性TGF-β1刺激條件下,eIF6+/-雜合子及野生型細(xì)胞中Smad蛋白的表達(dá)。
3.應(yīng)用Western blotting技術(shù)檢測在用SB431542阻斷TGF-β/Smad信號通路后,eIF6+/-雜合子及野生型細(xì)胞中p-Smad2及α-SMA蛋白的表達(dá)。
結(jié)果:
1.Real-Time PCR實驗結(jié)果顯示,TGF-β1(Tgfb1) mRNA在eIF6+/-雜合子細(xì)胞中的表達(dá)
12、顯著高于其在野生型細(xì)胞中的表達(dá)量,Tgfb1 mRNA表達(dá)增高2.7倍(P<0.001,n=5)。ELISA實驗也發(fā)現(xiàn)eIF6+/-雜合子細(xì)胞分泌到培養(yǎng)上清中的TGF-β1也明顯增高(增高1.8倍,P<0.001,n=5)。
2.Real-Time PCR實驗結(jié)果顯示,Tgfbr1及Tgfbr2 mRNA的表達(dá)在eIF6+/-雜合子細(xì)胞及野生型細(xì)胞中無顯著差異(P=NS,n=3)。Western blotting實驗結(jié)果顯示:
13、較野生型細(xì)胞相比,eIF6+/-雜合子細(xì)胞中p-Smad2蛋白的表達(dá)增高1.5倍(P=0.008,n=3),與此同時抑制性Smad7蛋白的表達(dá)量在eIF6+/-雜合子細(xì)胞中降低50%(P=0.002,n=3)。eIF6+/-雜合子細(xì)胞中p-Smad3蛋白的表達(dá)也增高了,但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=NS,n=3)。
3.Western blotting實驗結(jié)果表明,SB431542處理可顯著抑制eIF6+/-雜合子細(xì)胞中p-Sm
14、ad2及α-SMA的增高,使其表達(dá)水平與在野生型細(xì)胞中表達(dá)量相當(dāng)。
第四部分 eIF6通過影響TGF-β1轉(zhuǎn)錄調(diào)控皮膚肌成纖維細(xì)胞分化的機(jī)制探究
方法:
1.應(yīng)用多核糖體譜實驗技術(shù)檢測TGF-β1 mRNA在野生型細(xì)胞組與eIF6+/-雜合子細(xì)胞中翻譯效率。
2.用放線菌素D(actinomycin D)預(yù)處理細(xì)胞旨在抑制細(xì)胞中新的mRNA的合成,并在處理后不同時間通過Real-Time PCR的
15、方法檢測細(xì)胞中原有mRNA隨時間降解的情況,比較TGF-β1 mRNA在野生型細(xì)胞組與eIF6+/-雜合子細(xì)胞中mRNA穩(wěn)定性差異。
3.亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)檢測肌成纖維細(xì)胞中TGF-β1啟動子區(qū)域甲基化程度。
4.應(yīng)用定量蛋白組學(xué)iTRAQ技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantitation)篩選野生型
16、及eIF6基因表達(dá)缺陷的肌成纖維細(xì)胞中差異表達(dá)蛋白,并進(jìn)行Westernblotting實驗驗證。
5.應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)技術(shù)檢測組蛋白變體H2A.Z和轉(zhuǎn)錄因子Sp1與TGF-β1基因啟動子區(qū)域的結(jié)合情況,并用Real-Time PCR方法對相同處理條件下TGF-β1 mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測。
結(jié)果:
1.多核糖體譜實驗發(fā)現(xiàn),在含有質(zhì)量大的多聚核糖體的餾分中TGF-β1 mRNA的含量在野生型細(xì)
17、胞組與eIF6+/-雜合子細(xì)胞組無顯著差異。
2.TGF-β1 mRNA在野生型細(xì)胞組與eIF6+/-雜合子細(xì)胞中的半衰期均為10.5h,兩組間TGF-β1 mRNA穩(wěn)定性并無差異。
3.BSP實驗結(jié)果顯示:在野生型細(xì)胞組TGF-β1啟動子甲基化比例為61.9%,在eIF6+/-雜合子細(xì)胞組TGF-β1啟動子甲基化比例為73.8%,二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義
4.iTRAQ實驗發(fā)現(xiàn)302個與eIF6表達(dá)缺陷相關(guān)的
18、差異表達(dá)蛋白。Go分析發(fā)現(xiàn),eIF6表達(dá)缺陷導(dǎo)致表達(dá)下調(diào)的差異蛋白與染色體\染色質(zhì)組裝、染色質(zhì)聚集\解聚、DNA包裝、蛋白-DNA復(fù)合物聚集以及核小體聚集密切相關(guān)。其中,eIF6表達(dá)缺陷導(dǎo)致一些組蛋白的表達(dá)顯著降低。在這些差異表達(dá)的組蛋白中,變化程度最大的為Histonevariant H2A.Z(表達(dá)下降50%,P=4.30×10-11<0.0001)以及Histone H2B(表達(dá)下降約40%,P=1.11×10-5<0.0001)
19、。我們通過Western blotting實驗對部分差異表達(dá)蛋白進(jìn)行驗證,結(jié)果發(fā)現(xiàn),較野生型細(xì)胞相比,組蛋白H2B及組蛋白變體H2A.Z在eIF6+/-雜合子細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低,H2B蛋白表達(dá)降低了45%,H2A.Z蛋白降低了40%(P=0.051,n=3),該結(jié)果與定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。此外,我還通過Real-Time PCR技術(shù)檢測了eIF6+/-雜合子細(xì)胞中的H2A.Z(H2afz) mRNA的表達(dá),H2afz mRNA表達(dá)較
20、野生型細(xì)胞中降低了20%(P=0.015,n=3)
5.ChIP-qPCR實驗結(jié)果顯示,經(jīng)外源性TGF-β1預(yù)處理的野生型細(xì)胞及eIF6+/-雜合子細(xì)胞,在eIF6+/-雜合子細(xì)胞中H2A.Z與TGF-β1啟動子相應(yīng)區(qū)域的結(jié)合較野生型細(xì)胞相比顯著降低,而此時在野生型細(xì)胞中TGF-β1啟動子相應(yīng)區(qū)域有大量的H2A.Z蛋白的結(jié)合(相應(yīng)結(jié)合區(qū)域為區(qū)域1:-120/+73;區(qū)域2:-37/+175;區(qū)域3:-118/+246)。此外,
21、ChIP-qPCR實驗結(jié)果也顯示:eIF6+/-雜合子細(xì)胞中Sp1結(jié)合TGF-β1啟動子的量顯著高于其在野生型細(xì)胞中的結(jié)合量,并且結(jié)合區(qū)域包含所有Sp1在TGF-β1啟動子上的預(yù)期結(jié)合位點。與此同時,在外源性TGF-β1刺激的條件下TGF-β1誘導(dǎo)自身mRNA表達(dá)量在eIF6+/-雜合子細(xì)胞中顯著增高,是野生型細(xì)胞表達(dá)量的3.4倍(P=0.001,n=5)。
結(jié)論:
1.eIF6參與調(diào)控肌成纖維細(xì)胞的分化,eIF6表
22、達(dá)缺陷誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞分化,促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA、合成膠原及增強(qiáng)細(xì)胞收縮膠原的能力。
2.eIF6負(fù)性調(diào)控肌成纖維細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá),并且該調(diào)控作用主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄層面。
3.eIF6表達(dá)缺陷通過下調(diào)組蛋白變體H2A.Z對TGF-β1啟動子的結(jié)合,可能通過增加染色質(zhì)的空間可接近性,從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Sp1對TGF-β1啟動子的結(jié)合,導(dǎo)致TGF-β1轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)。
4.TGF-β/Smad信號通路
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