銀杏葉綠素降解酶的誘導表達研究.pdf

1、銀杏是著名的活化石植物，具有很高的藥用、食用和科研價值。銀杏葉綠素在秋季大規(guī)模降解時葉色變黃明顯，葉綠素含量也與黃酮含量呈現(xiàn)相關(guān)性。因此研究銀杏葉綠素降解酶有重要的科研和應(yīng)用價值。 本論文主要分為四部分： 外源因子對離體葉片的葉綠素降解和酶活性的影響：用銀杏葉為材料，采用葉圓片試驗系統(tǒng)，添加植物激素、碳源、氮源、金屬離子，定時取樣測定葉綠素含量以及葉綠素酶活性，考察外源因子對離體銀杏葉片中葉綠素酶的活性影響。結(jié)果表明：葉

2、綠素含量與銀杏葉綠素酶活性并不總是成反比，不同的因素處理得到的二者的相互關(guān)系不同。對于植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(6-BA)，隨著葉綠素含量的增加，葉綠素酶活性保持在較高水平；對于碳源、氮源，葉綠素含量的降低伴隨著較高的葉綠素酶活性水平；對于金屬離子，隨著葉綠素的降解，葉綠素酶活性也降低。 銀杏組織培養(yǎng)體系的建立以及外源因子對組培茁葉綠素降解和酶活性的影響：用銀杏胚為外植體，以MS、6，7-V培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，進行組織培養(yǎng)。待子葉展開后

3、定時取樣測葉片中的葉綠素含量以及葉綠素酶的酶活性。確定MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，最佳取樣時間為第七天。將正常生長的小苗在轉(zhuǎn)入添加有乙烯、6-BA、葡萄糖、6-BA和葡萄糖的組合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，定時取樣，測定葉綠素酶活。活體內(nèi)的葉綠素酶酶活受很多因素的影響，其活性變化體現(xiàn)了諸多因素的動態(tài)制衡關(guān)系；1200ppm的乙烯利處理能夠顯著提高葉綠素酶活性。 銀杏葉葉綠素酶的提?。?0g銀杏葉加入200ml冷丙酮，勻漿、抽濾制得丙酮粉。從丙酮

4、粉中提取葉綠素酶，提取條件為：20mmol/L，含0.24％(v/v)TritonX-100的磷酸緩沖液(pH7.0)。提取最佳時間為1h。對粗酶液進行酶學性質(zhì)分析，確定銀杏葉綠素酶反應(yīng)體系為底物：緩沖液：酶液=1:9:1。最適反應(yīng)條件為：溫度37℃、pH7.0、底物濃度1.6mmol/L。 銀杏葉葉綠素酶的分離純化：粗酶經(jīng)過有機溶劑沉淀、DEAE-離子交換柱層析、制備型聚丙烯酰胺凝膠電泳純化，純化后的酶蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢