以慢病毒為載體將SOX5、6、9和Chondromodulin-I基因轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、Ifl《‘以慢病毒為載體將sox5、6、9和ChondromodulinI基因轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究APilotStudyonSOX5，6，9趾dChondromodulinIgenest眥sfecthumallbonemarro、驢derivedmesenchymalstemcellsbylentiVir吣復(fù)旦大學(xué)2006級(jí)外科學(xué)七年制臨床型碩士研究生中山醫(yī)院整形外科徐文龍研究生導(dǎo)師：徐劍煒主任醫(yī)師導(dǎo)師組成員：景乃禾研究員楊

2、異鳳助理研究員本課題受國(guó)家自然科學(xué)基金面上研究項(xiàng)目(編號(hào)：30471792)資助2，，Jf0》，●■■中文摘要中文摘要【目的】1分離、擴(kuò)增和純化人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)和人軟骨細(xì)胞。2構(gòu)建慢病毒載體，將SOX5、6、9和ChondromodulinI基因轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。【方法】1分離、擴(kuò)增和純化BMSCs和人軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)：從復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院骨科接受脊柱或骨盆手術(shù)的2050歲患者(男女不限)廢棄的胸椎、腰椎椎體或髂骨

3、中提取35ml骨髓，經(jīng)密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞，通過黏附貼壁篩選及傳代擴(kuò)增，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面相對(duì)特異性分子(CD29、CDl05和CDl66)陽(yáng)性率以明確BMSCs的純度。利用復(fù)旦大學(xué)附屬耳鼻喉科醫(yī)院2040歲接受鼻中隔軟骨切除手術(shù)的患者(男女不限)廢棄的鼻中隔軟骨分離軟骨細(xì)胞、體外培養(yǎng)擴(kuò)增，分別用常規(guī)培養(yǎng)劑和添加生長(zhǎng)因子(TGFB110ng／ml，IGF150n幽_Ill，Dex40n幽：111)進(jìn)行體外培養(yǎng)、擴(kuò)增，通過

4、形態(tài)觀察、生長(zhǎng)曲線描繪，并經(jīng)免疫熒光、RTPCR方法檢測(cè)軟骨特異性標(biāo)志物，觀察其間的差別。2慢病毒載體構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)和慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs實(shí)驗(yàn)：利用已提取的SOX5，6，9基因質(zhì)粒和克隆的ChondromodulinIcDNA，包裝構(gòu)建慢病毒載體，將構(gòu)建好的融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞(人BMSCs)，通過熒光顯微鏡觀察融合蛋白GFP、weStemblot、免疫熒光、RTPCR等檢測(cè)方法檢測(cè)過表達(dá)基因的表達(dá)情況，以明確轉(zhuǎn)染效果，為進(jìn)一步研究