慢性社會應(yīng)激對雄鼠生精功能的損傷及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　慢性應(yīng)激(Chronic stress)是指機(jī)體長期經(jīng)受不利刺激的作用（即應(yīng)激原）時所引發(fā)的普遍存在的自然反應(yīng)。2007年至2010年世界范圍內(nèi)的流行病學(xué)調(diào)查顯示，慢性應(yīng)激狀態(tài)普遍存在于中青年人群中，且發(fā)生率呈現(xiàn)增長趨勢。與此同時，全球男性生殖功能（尤其是精液質(zhì)量）逐年下降可能與生活習(xí)慣、社會、環(huán)境與心理健康等因素密切相關(guān)。我們主要關(guān)注慢性應(yīng)激對男性生殖功能的作用，初步實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)慢性應(yīng)激主要通過激活下丘腦-

2、垂體-腎上腺(HPA)軸持續(xù)釋放多種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，導(dǎo)致生殖系統(tǒng)功能障礙，但具體分子機(jī)制尚未研究明確。臨床研究結(jié)果同樣證實(shí)慢性應(yīng)激是精液質(zhì)量下降的主要危險因素之一。
　　在慢性應(yīng)激激活HPA軸釋放的多種激素中，促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。CRH主要由下丘腦室旁核(PVN)分泌，通過血液運(yùn)輸至垂體前葉，并與促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體(CRHR)結(jié)合后促進(jìn)垂體合成和分泌促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH);也可經(jīng)

3、血液運(yùn)輸至外周靶器官。研究發(fā)現(xiàn)CRHR也較多的表達(dá)在睪丸和附睪中，但關(guān)于雄性生殖系統(tǒng)內(nèi)CRH及CRHR功能作用的研究報道較少，存在巨大的研究空間。
　　Nectin蛋白家族是一種重要的細(xì)胞間粘附分子，廣泛存在于大腦的海馬、上皮細(xì)胞、睪丸組織等部位，在細(xì)胞粘著、細(xì)胞遷移和細(xì)胞極化中發(fā)揮重要作用。而Nectin蛋白家族在睪丸內(nèi)主要表達(dá)Nectin-2（位于支持細(xì)胞上）和Nectin-3（位于晚期精子的頭部胞膜上），兩者相互連接形成支持

4、細(xì)胞-精子細(xì)胞連接(Sertoli cells-spermatidjunctions，SsJ)的結(jié)構(gòu)。支持細(xì)胞可以通過Nectin-2營養(yǎng)和維持晚期精子的發(fā)育，防止未成熟的精子脫落，促進(jìn)晚期精子的伸長和向精曲小管中央遷移等作用?；蚯贸齆ectin蛋白家族的任意一種均會影響晚期精子的發(fā)育和誘發(fā)雄鼠不育;Nectin蛋白家族表達(dá)紊亂同樣不利于精子的發(fā)育成熟。故支持細(xì)胞-精子細(xì)胞連接(SsJ)結(jié)構(gòu)在精子的發(fā)育成熟過程中作用重大。
　　

5、Wang等研究發(fā)現(xiàn):慢性應(yīng)激通過CRH-CRHR1通路誘發(fā)大腦海馬組織內(nèi)Nectin-3表達(dá)量的下降，從而損害小鼠學(xué)習(xí)和認(rèn)知等功能。我們課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)慢性社會應(yīng)激后小鼠睪丸組織內(nèi)Nectin-3的表達(dá)也有所下降。
　　我們推測Nectin蛋白家族表達(dá)變化與慢性應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)，并可能成為慢性應(yīng)激誘發(fā)生精障礙的分子靶點(diǎn);慢性應(yīng)激時睪丸內(nèi)CRH含量增加，可能直接或者通過CRHR1間接影響睪丸內(nèi)Nectin蛋白家族的改變。

6、　　因此，本研究的主要從以下幾個方面展開:(1)構(gòu)建合適的慢性應(yīng)激模型，(2)探討慢性應(yīng)激對雄鼠生精功能的影響;(3)探索慢性應(yīng)激對雄鼠睪丸組織內(nèi)Nectin蛋白家族的影響;(4)探究慢性應(yīng)激時Nectin蛋白家族的變化與CRH-CRHR途徑是否相關(guān)。
　　方法:
　　1.構(gòu)建慢性應(yīng)激的動物模型:建立慢性社會挫敗應(yīng)激模型，通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)（社會交互作用和曠場實(shí)驗(yàn)）的改變評估模型的構(gòu)建效果。
　　2.評估慢性應(yīng)激后生殖指標(biāo)

7、的改變:檢測各生殖腺的重量、附睪尾內(nèi)精子質(zhì)量（精子計數(shù)，精子畸形率）;固定睪丸制備成組織切片，經(jīng)HE染色后觀察睪丸組織學(xué)改變;與雌鼠進(jìn)行合籠實(shí)驗(yàn)，觀測合籠至后代產(chǎn)生所需時間。
　　3.明確Nectin蛋白家族和CRHR的定位與表達(dá)變化:通過免疫熒光染色來明確Nectin-3、Nectin-2和CRHR1在睪丸的分布;運(yùn)用Western Blot法檢測慢性應(yīng)激后和解除應(yīng)激后雄性小鼠睪丸中Nectin-3和Nectin-2的表達(dá)水平;

8、
　　4.評估CRH干預(yù)后生殖指標(biāo)與Nectin蛋白家族的變化:腹腔注射CRH模擬慢性應(yīng)激時血中CRH的高水平狀態(tài);檢測雄性小鼠的精液質(zhì)量;運(yùn)用Western Blot法檢測CRH干預(yù)后雄性小鼠睪丸中Nectin-3和Nectin-2的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)過25天慢性社會挫敗應(yīng)激后，應(yīng)激組小鼠表現(xiàn)出明顯的焦慮樣行為和社會逃避行為;并出現(xiàn)體重減輕、胸腺萎縮等典型慢性應(yīng)激的癥狀表現(xiàn)。
　　2.慢性社會應(yīng)

9、激后生殖腺的萎縮（睪丸和附睪尾萎縮），附睪尾精液的質(zhì)量（精子計數(shù)減少、精子畸形率升高）降低(P＜0.05)，睪丸的組織學(xué)結(jié)構(gòu)改變（睪丸切片顯示生精上皮變薄）。應(yīng)激組雄鼠與雌鼠合籠后產(chǎn)生后代的時間延長。
　　3.免疫熒光結(jié)果顯示: Nectin-2表達(dá)于睪丸的支持細(xì)胞上，Nectin-3表達(dá)于長線期精予的頭部，且Nectin-2與Nectin-3之間緊密相連。CRHR1表達(dá)于睪丸的間質(zhì)細(xì)胞上。與對照組相比，慢性社會應(yīng)激后Nectin

10、-3的表達(dá)減少(P＜0.05)，Nectin-2的和CRHR1表達(dá)增加(P＜0.05)。慢性應(yīng)激解除后（歷經(jīng)四個月）Nectin-3的表達(dá)恢復(fù)正常水平(P＞0.05)，Nectin-2表達(dá)仍有增加(P＜0.05)。
　　4.腹腔注射CRH后附睪尾內(nèi)精子數(shù)目減少;與對照組相比，CRH注射組睪丸內(nèi)Nectin-3表達(dá)量下降(P＜0.05)，Nectin-2表達(dá)量增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.慢性社會應(yīng)激誘發(fā)雄