白消安對公雞睪丸發(fā)育及精原干細(xì)胞移植效率的影響.pdf

1、精原干細(xì)胞具有自我復(fù)制和分化成精子的能力，是動物體內(nèi)唯一能進(jìn)行遺傳信息傳遞的干細(xì)胞。因此，精原干細(xì)胞既是干細(xì)胞生物學(xué)的重要研究對象，又是研究精子發(fā)生、制作轉(zhuǎn)基因動物和研究基因功能的重要資源。Brister等人于1994年創(chuàng)立的精原干細(xì)胞移植技術(shù)，以及Nagano等人于2001年和Hamra等人于2002年分別用不同的載體遺傳修飾精原干細(xì)胞成功地產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因小鼠或大鼠等研究為揭示精子發(fā)生過程和制作轉(zhuǎn)基因動物提供了新的方法?？上У氖沁@種技術(shù)

2、一直沒有應(yīng)用到禽類。在本研究中我們首先使用不同劑量的白消安誘導(dǎo)青春期和性成熟公雞，檢測白消安處理后雞睪丸形態(tài)變化、曲細(xì)精管的組織學(xué)變化，通過所得數(shù)據(jù)分析白消安對青春期和性成熟公雞睪丸發(fā)育的影響，確定受體所需劑量和誘導(dǎo)時間，進(jìn)行精原干細(xì)胞(標(biāo)記有EGFP)移植，在移植后7周所采集到的精液中，檢測出表達(dá)EGFP。 我們選取了15周齡的青春期公雞和24周齡的性成熟公雞。按30 mg/Kg、40mg/kg、50 mg/kg、60 mg

3、/kg和0 mg/kg進(jìn)行腹腔注射15周齡公雞，按50 mg/kg、60 mg/kg和0 mg/kg進(jìn)行腹腔注射24周齡公雞。注射時于373℃水浴中保持恒溫，防止注射液凝固。分白消安誘導(dǎo)5 d、10 d、15 d、20 d、25 d、30 d、60 d共七個梯度處死公雞，去除睪丸，稱量公雞體重及其睪丸的重量，將睪丸石蠟包埋。 實驗中青春期公雞注射白消安后睪丸發(fā)育不同程度受阻，30 mg/kg實驗組在注射白消安后睪丸質(zhì)量與對照組

4、同步上升，說明該劑量白消安對青春期公雞的精原干細(xì)胞作用很小。40 mg/kg實驗組睪丸質(zhì)量在白消安處理20和25天時與對照組有顯著差異，說明該劑量效用要高于30 mg/kg，但是在白消安處理30和60天時睪丸質(zhì)量與對照組無顯著差異。本實驗中50 mg/kg和60 mg/kg白消安對青春期公雞睪丸發(fā)育作用非常顯著，致使公雞在白消安處理60天后睪丸仍未能恢復(fù)至正常大小。但60 mg/kg劑量明顯快于50 mg/kg，60 mg/kg劑量的白

5、消安處理10天時就已經(jīng)起作用，而50 mg/kg在處理15天時才影響了公雞的睪丸發(fā)育。表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)。 成熟期公雞注射注射不同劑量白消安后睪丸也不同程度受阻，實驗組在注射白消安后30 d內(nèi)睪丸質(zhì)量持續(xù)下降，與對照組差異顯著，在注射白消安60后睪丸質(zhì)量仍未能回到正常水平。試驗過程中60 mg/kg實驗組睪丸質(zhì)量低于50 mg/kg實驗組，但差異不顯著，未表現(xiàn)出劑量效應(yīng)。 白消安處理青春期和成熟期公雞對其體重也產(chǎn)生

6、了很大的影響。從處理青春期公雞15天開始一直至60天，50 mg/kg和60 mg/kg實驗組的公雞體重顯著低于30 mg/kg、40 mg/kg實驗組及對照組。60 mg/kg白消安處理性成熟公雞10天時公雞體重就顯著低于50 mg/kg實驗組和對照組，一直持續(xù)到白消安處理60天。 為了進(jìn)一步驗證白消安對睪丸發(fā)育的影響，我們又對睪丸石蠟切片進(jìn)行了組織學(xué)分析。發(fā)現(xiàn)白消安誘導(dǎo)性成熟和青春期公雞后，50 mg/kg白消安處理15

7、d和60mg/kg白消安處理10 d時曲細(xì)精管細(xì)胞開始脫落，管腔中精子數(shù)量開始減少；之后曲精細(xì)管細(xì)胞不斷脫落，管壁不斷溶解，中空的曲細(xì)精管不斷增加；在50 mg/kg白消安處理30 d和60 mg/kg白消安處理25 d時多數(shù)曲細(xì)精管表現(xiàn)為中空，只剩下1層細(xì)胞，只有少數(shù)曲細(xì)精管有多層細(xì)胞，為外源精原干細(xì)胞提供了一定數(shù)量的巢(niche)；60 mg/kg白消安處理30 d時視野中曲細(xì)精管已經(jīng)都嚴(yán)重萎縮，只剩下1層支持細(xì)胞。 實

8、驗過程中60 mg/kg白消安對睪丸發(fā)育的影響要明顯快于并強(qiáng)于其它劑量，表現(xiàn)了公雞睪丸對高劑量白消安的敏感性。50 mg/kg白消安處理性成熟公雞60天時，曲精細(xì)管細(xì)胞從30天時的1—2層細(xì)胞恢復(fù)至2—4細(xì)胞，說明50 mg/kg白消安在處理30-60天時進(jìn)行了精原干細(xì)胞恢復(fù)，該時間段可能是性成熟公雞精原干細(xì)胞移植的最佳時間。60 mg/kg白消安處理60天時曲精細(xì)管細(xì)胞曲精細(xì)管細(xì)胞仍是支持細(xì)胞，說明該劑量和時間不適合精原干細(xì)胞移植。6

9、0 mg/kg白消安處理青春期公雞60天時，曲精細(xì)管仍只有一層支持細(xì)胞，且部分支持細(xì)胞脫落，說明該劑量和時間不適合精原干細(xì)胞移植。50 mg/kg白消安處理青春期公雞60天時，曲精細(xì)管也只有一層支持細(xì)胞，未發(fā)生精子發(fā)生重建，說明該劑量和時間也不適合精原干細(xì)胞移植。 為了確定上述分析，我們進(jìn)行了精原干細(xì)胞移植實驗。白消安(50 mg/kg)誘導(dǎo)青春期和成熟期30天的公雞作為受體，供體細(xì)胞來自轉(zhuǎn)EGFP的16～19d雞胚胎細(xì)胞，移