雙層魚膠原膜作為微粒皮移植覆蓋物的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　創(chuàng)面修復(fù)是燒傷領(lǐng)域永恒的命題，尤其對(duì)于大面積燒傷患者，創(chuàng)面修復(fù)尤其關(guān)鍵，直接關(guān)系到患者的存活率及生存質(zhì)量。大面積創(chuàng)面引起機(jī)體應(yīng)激嚴(yán)重，消耗過度，并且容易引細(xì)菌定植、進(jìn)而引起全身感染，導(dǎo)致全身臟器損傷。盡早的覆蓋創(chuàng)面是燒傷患者治療的關(guān)鍵，因而創(chuàng)面覆蓋物的選擇與進(jìn)展是貫穿燒傷發(fā)展始終的，其中包括臨時(shí)覆蓋物與永久的覆蓋物。永久的覆蓋主要指真皮替代物和字體皮，大面積救治治療過程中應(yīng)用的主要植皮方式有:Meek植皮術(shù)、自異體

2、混合植皮術(shù)、微粒皮移植術(shù)以及自體表皮細(xì)胞培養(yǎng)移植等，然而，任何一種植皮方式都需要合適的臨時(shí)覆蓋物來覆蓋間隙以及保證永久覆蓋物存活。臨時(shí)覆蓋物的發(fā)展也對(duì)創(chuàng)面修復(fù)起到了重要的作用，臨時(shí)覆蓋從傳統(tǒng)的紗布、凡士林紗布、陰離子輔料等到膠原膜或膠原支架覆蓋物，應(yīng)用越來越廣泛。因此，創(chuàng)面覆蓋物的更新發(fā)展，也是創(chuàng)面修復(fù)技術(shù)的發(fā)展的重要支持。
　　在大面積燒傷封閉創(chuàng)面的過程中，各種植皮方式應(yīng)用各有利弊。其中，Meek植皮術(shù)多應(yīng)用于早起切痂后覆蓋創(chuàng)面

3、，實(shí)現(xiàn)了擴(kuò)展比例可為1∶3至1∶9，并且實(shí)現(xiàn)了機(jī)械化，但是擴(kuò)展比例有限;自異體混合植皮術(shù)，植皮存活率穩(wěn)定，但存在手術(shù)重復(fù)操作多，耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn);自體表皮細(xì)胞培養(yǎng)移植，理論可擴(kuò)展1000倍，但是存在創(chuàng)面愈合質(zhì)量差的問題;微粒皮移植術(shù)理論上可擴(kuò)展100倍，臨床應(yīng)用可擴(kuò)展10～20倍，但是存在覆蓋物選擇、方向性及均一性等臨床難題。本研究著眼于微粒皮移植，覆蓋物的選擇一直是影響微粒皮移植成活率的重要因素，活性高的異體皮是理想的微粒皮移植覆蓋物，但

4、是異體皮來源受限往往限制了大面積燒傷患者的微粒皮移植開展，因而，尋找一種可以模擬皮膚功能的覆蓋物對(duì)微粒皮移植十分關(guān)鍵。
　　在諸多覆蓋物材料的發(fā)展中，其中在創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域，膠原材料的使用越來越廣泛。膠原自身為創(chuàng)面修復(fù)過程中所需要的重要成分，并且在皮膚及創(chuàng)面修復(fù)中起重要作用。并且，膠原的獲取途徑越來越多，提取方式及加工方式越來越成熟。在創(chuàng)面修復(fù)方面，膠原的應(yīng)用也越來越廣泛，已有的產(chǎn)品包括真皮替代物及外用敷料。近年來，魚來源的膠原材料越

5、來越多的應(yīng)用在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，其中包括止血材料及創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域，如何利用魚膠原材料促進(jìn)創(chuàng)面愈合具有重大臨床意義。
　　本研究旨在尋找一種可替代異體皮膚功能的生物敷料，結(jié)合魚膠原的應(yīng)用發(fā)展，構(gòu)建一種模擬皮膚結(jié)構(gòu)功能的雙層魚膠原膜，并將之應(yīng)用于微粒皮移植覆蓋物，為微粒皮移植提供一種來源廣泛的覆蓋物選擇，從而使微粒皮移植在大面積燒傷患者的創(chuàng)面修復(fù)中應(yīng)用更廣，創(chuàng)面修復(fù)效率更高。
　　第一部分:雙層魚膠原膜(FCM-B)的構(gòu)建
　　研究

6、目的:制備一種模擬皮膚結(jié)構(gòu)，包含表皮真皮，并且在功能上模擬皮膚的雙層膠原敷料，外層可以模擬表皮致密并且韌性高具備保護(hù)及隔絕功能;內(nèi)層疏松柔軟，具備良好的貼附功能。用于創(chuàng)面可以達(dá)到吸收滲液，并且可以保護(hù)創(chuàng)面。
　　研究方法:利用食用廢料的羅非魚魚皮與魚鱗，經(jīng)酸聯(lián)合酶消化提取技術(shù)，提取并純化魚膠原。在不添加具有毒性的交聯(lián)劑的基礎(chǔ)上，應(yīng)用不同的交聯(lián)方法可以獲得理化特性差別明顯的膠原膜。利用脫水熱處理(DHT，dehydrothermal

7、 treatment)交聯(lián)的方法得到外層魚膠原膜(FCM-O，F(xiàn)ish Collagen Membrane Outer-layer)，利用真空冷凍干燥(FC，vacuum Frozen drying)技術(shù)得到內(nèi)層魚膠原膜(FCM-I，F(xiàn)ish CollagenMembrane Inner-layer)。將制備好的FCM-O提前鋪在制備FCM-I的模具底部，再次利用真空冷凍干燥技術(shù)，制備成膜。
　　研究結(jié)果:成功制備具有雙層結(jié)構(gòu)，外

8、層致密柔韌，內(nèi)層疏松柔軟的雙層魚膠原膜，從外觀上和質(zhì)地上與人皮膚具有相似性。
　　第二部分:雙層魚膠原膜(FCM-B)的特性研究
　　研究目的:通過FCM-B的結(jié)構(gòu)特性及理化特性檢測(cè)來驗(yàn)證雙層魚膠原膜與皮膚結(jié)構(gòu)和功能上的相似性。
　　研究方法:
　　1.結(jié)構(gòu)觀察
　　1.1.組織學(xué)觀察利用FCM-B冰凍切片，行HE染色、Massion染色，觀察其結(jié)構(gòu)與膠原排列情況，并與正常皮膚組織切片做對(duì)比，觀察其結(jié)構(gòu)的相

9、似性;
　　1.2.電鏡掃描觀察并對(duì)FCM-B進(jìn)行掃描電鏡掃描，觀察膠原膜的結(jié)構(gòu)，觀察各層次的表征，并測(cè)量各層次的厚度。
　　2.物理特性
　　2.1.力學(xué)性能取FCM-O，F(xiàn)CM-I及FCM-B啞鈴型樣本，利用Instron5567材料測(cè)試系統(tǒng)(Instron，USA)，進(jìn)行力學(xué)測(cè)試，獲得楊氏模量、斷裂伸長(zhǎng)率及斷裂強(qiáng)度等指標(biāo)，重復(fù)測(cè)量3遍。
　　2.2.水蒸氣透過率(WVTR，Water Vapor Trans

10、mission Rate)取直徑3.5cm的FCM-O，F(xiàn)CM-I及FCM-B樣本，使用水蒸氣透過率檢測(cè)儀（W3/030，Labthink，中國）獲得結(jié)果，測(cè)量重復(fù)3次。
　　2.3.吸收容量(C％)將已經(jīng)制備好的三種膠原膜用雙蒸水浸泡，在相同環(huán)境浸泡相同時(shí)間直至膠原膜充分吸收水分，通過測(cè)量浸泡前后膠原膜質(zhì)量變化計(jì)算C％。
　　3.生物化學(xué)特性
　　3.1.生物可降解性將制備的FCM-B、FCM-O及FCM-I用PBS

11、處理，浸泡前后的干重計(jì)算降解速率，并計(jì)算半量降解時(shí)間t1/2。
　　3.2.細(xì)胞毒性將FCM浸提液按一定濃度剃度加入等量人成纖維細(xì)胞懸液中，使用CCK-8試劑盒，通過檢測(cè)吸光度(OD)值，計(jì)算成纖維細(xì)胞的相對(duì)增值率。
　　統(tǒng)計(jì)方法:FCM的各項(xiàng)指標(biāo)（計(jì)量資料）結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;兩組值之間應(yīng)用t檢驗(yàn);多組組比較應(yīng)用oneway-ANOVA分析，實(shí)驗(yàn)組與各組間比較應(yīng)用SNK檢驗(yàn)。
　　研究結(jié)果:
　　1.結(jié)

12、構(gòu)觀察組織學(xué)切片結(jié)果顯示FCM-B冰凍切片與正常皮膚組織切片在雙層結(jié)構(gòu)和膠原排列上具有結(jié)構(gòu)相似性;電鏡掃描結(jié)果顯示FCM-B在厚度與孔隙上上與皮膚表皮真皮具有相似性。
　　2.物理學(xué)特性通過檢測(cè)測(cè)得FCM-I機(jī)械性能顯著FCM-O(p＜0.05); FCM-I的WVTR顯著高于FCM-O(p＜0.05)，F(xiàn)CM-B的WTVR接近正常皮膚水平。FCM-I吸收容量顯著高于FCM-O(p＜0.05)。
　　3.生物化學(xué)性能檢測(cè)體外

13、降解時(shí)間T1/2(FCM-O)約為15天;T1/2(FCM-I)約為21天，F(xiàn)CM-O的生物降解時(shí)間明顯長(zhǎng)于FCM-I(p＜0.05)。細(xì)胞毒性試驗(yàn)表明FCM浸提液對(duì)人成纖維細(xì)胞增值率無顯著影響。
　　第三部分:雙層魚膠原膜(FCM-B)覆蓋SD大鼠微粒皮移植實(shí)驗(yàn)
　　研究目的:為了驗(yàn)證雙層膠原膜在微粒皮移植過程中能起到異體皮的作用，能夠促進(jìn)微粒皮移植創(chuàng)面的愈合。
　　研究方法:SD大鼠背部做直徑2cm的圓形全層皮膚缺

14、損創(chuàng)面，根據(jù)1∶10的比例將取下的皮膚取薄皮制備成微粒，回植在創(chuàng)面上，根據(jù)覆蓋物的不同分為空白對(duì)照組、異體皮覆蓋組及FCM-B、FCM-I、FCM-O覆蓋組，觀察不同覆蓋物對(duì)微粒皮移植存活的影響，計(jì)算創(chuàng)面愈合率及收縮率;留取組織標(biāo)本，分別進(jìn)行膠原(Massion)染色、HE染色，觀察表皮細(xì)胞生長(zhǎng)情況及創(chuàng)面的膠原分布情況。
　　統(tǒng)計(jì)方法:多組組比較應(yīng)用oneway-ANOVA分析，實(shí)驗(yàn)組與各組間比較應(yīng)用SNK檢驗(yàn)。
　　研究結(jié)

15、果:實(shí)驗(yàn)早期發(fā)現(xiàn)FCM-I、FCM-O創(chuàng)面愈合不佳，在3周時(shí)FCM-B覆蓋組與異體皮覆蓋組的創(chuàng)面愈合率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，創(chuàng)面收縮率異體皮覆蓋組低于FCM-B(p＜0.05)，組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)上皮形成厚度FCM-B組大于異體皮覆蓋組(p＜0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　本研究構(gòu)建的雙層膠原膜，在結(jié)構(gòu)上與皮膚的表皮真皮具有高度的相似性，并且在理化特性上接近理想創(chuàng)面覆蓋物要求，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，F(xiàn)CM-B替代同