毛囊干細胞脫細胞支架復合物修復兔膀胱缺損的研究.pdf

1、目的:
　　(1)比較不同毛囊干細胞的培養(yǎng)方法，建立毛囊干細胞(Hair follicle stemcells，HFSCs)的體外培養(yǎng)方法，用目前公認的標記物和其他手段對其進行鑒定;
　　(2)尋找標記毛囊干細胞的方法，并用CM-Dil標記毛囊干細胞，探討CM-Dil標記毛囊干細胞的可行性，并觀察標記后的毛囊干細胞與膀胱脫細胞基質(zhì)共培養(yǎng)形成的細胞-支架復合物的熒光表達情況，保證移植細胞的質(zhì)量及標記細胞的示蹤效果;
　　

2、(3)誘導毛囊干細胞向平滑肌細胞分化并鑒定，觀察熒光標記細胞-支架復合物后細胞生長情況;
　　(4)評估細胞-支架復合物對于兔膀胱缺損模型的修補作用，觀察并鑒定細胞-支架復合物修補處特異性標記物的表達。
　　方法:
　　(1)選用出生2月的新西蘭兔，經(jīng)過嚴格消毒擬切除觸須部位后，切取含毛囊的組織，在無菌環(huán)境下使用顯微外科技術分離出毛囊組織和毛囊外根鞘部。用中性蛋白酶和胰酶消化毛囊外根鞘部;利用差速貼壁法篩選貼壁快的細胞

3、后，培養(yǎng)的細胞可供進一步傳代或冷凍處理。培養(yǎng)出來的細胞應用倒置顯微鏡、電子顯微鏡、Giemsa染色、免疫熒光染色、流式細胞儀等鑒定，將β1整合素、CK15、CD34，CK7等細胞表面標志物作為鑒定依據(jù);
　　(2)分離培養(yǎng)兔毛囊干細胞并鑒定，取CM-Dil儲存液5ul，用PBS稀釋成1ml的5ug/ml（即5uM）CM-Dil工作液。將貼壁生長、狀態(tài)良好P3代毛囊干細胞（細胞總量約為5～6×106）終止培養(yǎng)，將培養(yǎng)液吸出，用PBS

4、輕洗貼壁細胞2次，加入5ug/ml(即5uM)CM-Dil工作液，37℃孵育15min，-4℃孵育5min，PBS洗滌兩遍，加入體積為25ml的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，第2天換液。倒置相差熒光顯微鏡綠色熒光下進行觀察。將第三代MFSCs在轉化生長因子β1(TGF-β1)和骨形態(tài)蛋白4(BMP4)的作用下向平滑肌細胞誘導分化，用細胞免疫組化的方法檢測平滑肌細胞特異性標記物的表達;
　　(3)使用CM-Dil標記HFSCs并與兔膀胱脫細胞基

5、質(zhì)共培養(yǎng)成細胞-支架復合物，利用熒光倒置顯微鏡觀察標記后細胞及細胞-支架復合物，確定熒光標記情況;手術回植細胞-支架復合物至兔膀胱缺損模型觀察生長情況;取得實驗動物膀胱，選取修補位置，制成石蠟切片，使用熒光倒置顯微鏡觀察組織切片的熒光表達，利用免疫組化的方法檢測組織結構成分和平滑肌細胞特異性標記物的表達。
　　結果:
　　(1)第三代HFSCs在倒置顯微鏡下表現(xiàn)為幼圓鋪路石樣形態(tài)，二步酶法、顯微分離技術聯(lián)合免疫磁珠法、差速貼

6、壁法能很好的培養(yǎng)出毛囊干細胞;
　　(2)CM-Dil標記的第三代HFSCs熒光表達穩(wěn)定，與兔膀胱脫細胞基質(zhì)共培養(yǎng)得到的細胞-支架復合物仍有較強的熒光表達;TGF-β1和BMP4誘導鑒定后確定細胞的干細胞功能;HFSCs向平滑肌細胞誘導7天后，具有平滑肌細胞特有的“波峰-波谷”樣生長特點。表達平滑肌細胞特異性標記物:a-SMA;
　　(3)實驗兔分別于術后7d、16d各死亡一只，死因為漏尿;組織切片熒光表達有所減弱但仍存在，

7、與未修補位置界限較清，Masson染色發(fā)現(xiàn)組織結構齊全，肌纖維表達明顯，免疫組化表達平滑肌細胞特異性標記物:a-SMA。
　　結論:
　　(1)HFSCs原代獲取后，在體外培養(yǎng)條件下生長良好，并能維持干細胞的特性，能作為組織工程研究及應用的首選種子細胞;二步酶法、顯微分離技術聯(lián)合免疫磁珠法、差速貼壁法能很好的培養(yǎng)出毛囊干細胞;
　　(2)熒光標記的HFSCs在體內(nèi)能夠穩(wěn)定表達;TGF-β1和BMP4能使HFSCs向平滑