三種芽孢桿菌vip3A基因及特異Bt株上清液毒性成分研究.pdf

1、南開(kāi)大學(xué)碩士研究生畢業(yè)(學(xué)位)論文摘要摘要雖然以蘇云金芽孢桿菌(Bt)為主的生物農(nóng)藥的相關(guān)研究有了很大的發(fā)展，但是在Bt的應(yīng)用過(guò)程中仍有許多問(wèn)題需要解決。如目前仍有一些全球性重要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)對(duì)已發(fā)現(xiàn)的殺蟲(chóng)晶體蛋白仍不敏感，如鱗翅目的甜菜夜蛾，小地老虎等。另外，害蟲(chóng)對(duì)廣泛使用的ICPs產(chǎn)生了抗性，對(duì)單個(gè)Cry蛋白的抗性還會(huì)引起害蟲(chóng)對(duì)與之同源的殺蟲(chóng)蛋白的交叉抗性。存在于發(fā)酵上清液中的營(yíng)養(yǎng)殺蟲(chóng)蛋白(Vip)是一類(lèi)全新的殺蟲(chóng)物質(zhì)，與Cry蛋白沒(méi)有任

2、何同源性。對(duì)于解決上述問(wèn)題有著非常重要的意義。本文以本室多年來(lái)篩選保留，具有重要特異性的Bl以及有代表性的臘狀芽孢桿菌(Bc)和球形芽孢桿菌(Bs)菌株為試材，利用PCR方法檢測(cè)了30株Bt，19株顯示有特異擴(kuò)增帶，咖甜基因菌株陽(yáng)性率63％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以往文獻(xiàn)報(bào)道值(約15％)：檢測(cè)25株Bc，只有1株(B7B)顯示有特異擴(kuò)增帶，這是首次發(fā)現(xiàn)含有vip3A基因的Bc菌株，對(duì)于擴(kuò)大vip3A基因來(lái)源，豐富rip類(lèi)基因在不同種屬中分布的知識(shí)是

3、很有意義的；檢測(cè)Bs菌株共4株，沒(méi)有菌株顯示有特異擴(kuò)增帶。通過(guò)對(duì)高效特異株15A3和9816C菌株及其質(zhì)粒消除株的基因檢測(cè)，初步認(rèn)定vip3A基因定位于質(zhì)粒上。對(duì)含有vip3A基因的30株Bl菌株進(jìn)行PCRRFLP檢測(cè)分析，有四株(95125—6、L7601、7214及008)的酶切圖譜與已知的vip3A基因的圖譜不同，推測(cè)其可能至少含有三種潛在的新vip3A類(lèi)基因。其克隆、測(cè)序工作正在進(jìn)行。對(duì)含有vip3A基因菌株的發(fā)酵上清液對(duì)棉鈴蟲(chóng)

4、和甜菜夜蛾進(jìn)行了生物測(cè)定，發(fā)現(xiàn)半數(shù)以上菌株的上清至少對(duì)一種供試?yán)ハx(chóng)有活性。利用SDS—PAGE技術(shù)分析了部分殺蟲(chóng)活性較好菌株上清液的蛋白組成，發(fā)現(xiàn)vip3A基因陽(yáng)性株基本都含有約885KD蛋白帶。通過(guò)熱敏試驗(yàn)，以及對(duì)上清中卵磷酯酶C和溶血素的檢測(cè)排除了毒力因子是其他活性物質(zhì)的可能。通過(guò)比較15A3和9816C菌株及其質(zhì)粒消除株發(fā)酵上清液的殺蟲(chóng)活性以及SDSPAGE圖譜，確認(rèn)上清液中主要的殺蟲(chóng)物質(zhì)就是Vip3A蛋白。關(guān)鍵詞：蘇云金芽孢桿菌