發(fā)展及優(yōu)化高通量鈣熒光方法篩選TRPV3通道天然抑制劑及藥理學(xué)活性評價.pdf

1、分類號：R966R966密級：公開公開UDC：610610學(xué)校代碼：1106511065碩士學(xué)位論文發(fā)展及優(yōu)化高通量鈣熒光方法篩選TRPV3通道天然抑制劑及藥理學(xué)活性評價孫曉梅指導(dǎo)教師王克威（教授）學(xué)科專業(yè)名稱藥理學(xué)論文答辯日期2017年5月21日I發(fā)展及優(yōu)化高通量鈣熒光方法篩選發(fā)展及優(yōu)化高通量鈣熒光方法篩選TRPV3通道天然抑制劑通道天然抑制劑及藥理學(xué)活性評及藥理學(xué)活性評價摘要瞬時受體電位（TransientReceptPotenti

2、alTRP）通道家族成員TRPV3是一種鈣通透性、配體門控的非選擇性陽離子通道。TRPV3通道作為一種溫覺感受器，激活溫度范圍為33℃39℃，其主要分布于人體的背根神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)節(jié)和皮膚角化細胞等中樞神經(jīng)和外周感覺系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，TRPV3通道不僅與溫度感受相關(guān)，還與疼痛、瘙癢以及皮膚毛發(fā)生長等生理活動和病例有著密切的聯(lián)系。雖然TRPV3通道與眾多生理病理活動相關(guān)，但目前尚卻缺乏特異性作用于TRPV3通道的工具藥，使得TRPV3通道的

3、藥理學(xué)研究受到極大地限制。研究目的研究目的發(fā)展、優(yōu)化高通量篩選TRPV3通道調(diào)節(jié)劑的方法，尋找TRPV3通道的特異性抑制劑。研究方法研究方法采用FlexStation3儀器，通過優(yōu)化表達TRPV3通道的HEK293T細胞密度、Cal520鈣熒光染料的孵育時間和濃度、以及TRPV3的非特異性激動劑2APB樟腦與釕紅（TRPV3非選擇性抑制劑）的加藥先后順序等四個條件，對高通量鈣熒光篩選TRPV3離子通道調(diào)節(jié)劑的方法進行條件優(yōu)化；運用抑制劑

4、釕紅，評價2APB所致鈣熒光信號的增強是否來自直接通過激活TRPV3通道；通過應(yīng)用優(yōu)化后的高通量篩選方法，篩選靶向TRPV3通道的天然調(diào)節(jié)劑；應(yīng)用全細胞膜片鉗記錄進行活性確認及選擇性評價；對天麻干燥的塊莖運用減壓加熱回流、HPD100大孔吸附樹脂、ODS柱、硅膠柱、HPLC高效液相色譜儀，結(jié)合正向、反向薄層色譜對天麻有效成分進行提取分離；采用優(yōu)化的高通量篩選方法對天麻提取物進行靶向TRP通道的活性測定與評價。研究結(jié)果研究結(jié)果本研究成功建

5、立并優(yōu)化了高通量鈣熒光篩選TRPV3離子通道調(diào)節(jié)劑的方法，得到的最佳篩選條件為細胞密度40000個細胞孔、Cal520鈣熒光染料濃度為5.0%、孵育時間為1.5h、篩選TRPV3通道調(diào)節(jié)劑時應(yīng)先加入抑制劑再加入待測化合物進行測試；運用優(yōu)化的高通量鈣熒光方法，測得釕紅抑制TRPV3通道的半抑制濃度（IC50）為5.351.39?M，并從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了新的TRPV3通道抑制劑—甲基蓮心堿。全細胞膜片鉗記錄實驗測定甲基蓮心堿抑制TRPV3通