ISDR變異對聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林治療1b型慢性丙型病毒性肝炎療效的影響.pdf

1、背景：丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染常引起慢性肝病,感染HCV25～30年后肝硬化發(fā)生率為5％～25％,HCV相關(guān)肝硬化患者10年后肝功能失代償發(fā)生率為30％,肝細胞癌年發(fā)生率為1％～3％。目前尚無有效的疫苗預(yù)防。有效的抗病毒治療可改善患者長期生存率與生活質(zhì)量。因此,抗病毒治療的長期目標為降低HCV相關(guān)肝硬化、肝衰竭與肝細胞癌的發(fā)生率,降低HCV相關(guān)病死率,改善患者生活質(zhì)量。HCV感染一般病情緩慢進展,抗

2、病毒療效評價多采用短期的臨床指標,包括病毒學(xué)應(yīng)答、生化學(xué)應(yīng)答與肝組織學(xué)應(yīng)答等指標。其中病毒學(xué)應(yīng)答指標中的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(sustained virologicalresponse,SVR)是當前評判療效的最主要指標。SVR是指治療結(jié)束24周后應(yīng)用敏感PCR方法檢測血清HCV RNA仍為陰性,被視為疾病的“病毒學(xué)治愈”。
　　 干擾素(interferon,IFN)聯(lián)合利巴韋林(ribavirin,RBV)是目前慢性丙型肝炎(ch

3、ronic hepatitis C,CHC)抗病毒治療的標準方案。多項大型臨床研究均表明,聚乙二醇干擾素(Pegylated interferon,Peg-IFN)聯(lián)合RBV的方案SVR可達65％,療效明顯優(yōu)于普通IFN聯(lián)合RBV方案。
　　 HCV基因型是影響CHC患者抗病毒治療應(yīng)答的重要因素,不同基因型患者治療療程與方案不同,AASLD臨床指南推薦HCV1型患者Peg-IFN聯(lián)合足量RBV治療療程48周,而2型和3型患者應(yīng)用

4、Peg-IFN及低劑量的RBV治療療程24周,在患者開始抗病毒治療前,應(yīng)檢測HCV基因型。HCV基因型分布存在明顯地區(qū)和人群差異；HCV不同基因型和亞型感染者的臨床表現(xiàn)、肝病嚴重程度存在差異。由于目前國內(nèi)尚無市售HCV分型試劑盒可供使用,建立一種可靠、靈敏、簡潔、實用的HCV基因分型技術(shù),對丙型肝炎的臨床研究和相關(guān)的分子流行病學(xué)研究均具有重要意義。
　　 影響抗病毒療效的基線指標很多,其中患者基因型與基線HCV RNA載量是目前

5、最重要的兩個預(yù)測指標。其他指標還包括性別、年齡、體重、有無胰島素抵抗以及肝脂肪病變與纖維化程度、是否酗酒以及是否使用靜脈毒品等。這些預(yù)測指標有助于臨床醫(yī)生與患者對于可能的治療結(jié)局有充分的認知,也可作為個體化治療方案的依據(jù)。
　　 在中國、日本以及東南歐流行的HCV1b基因亞型感染抗病毒治療應(yīng)答較差。對于HCV1b型慢性丙型病毒性肝炎患者,單用普通干擾素治療SVR率只有10%～40％,標準抗病毒治療方案Peg-IFN聯(lián)合RBV治療

6、也僅達到約40％～50％。而Peg-IFN聯(lián)合RBV治療費用昂貴、副作用大。因此,病毒相關(guān)因素如基因型的檢測及1b型療效的影響因素預(yù)測將有助于臨床合理地選擇病例進行干擾素的治療,從而提高干擾素療效。
　　 日本學(xué)者Enomoto等研究發(fā)現(xiàn)HCV1b型NS5A2209～2248氨基酸序列氨基酸突變數(shù)目可作為干擾素抗病毒療效的獨立預(yù)測因素,并把該區(qū)命名為干擾素敏感性決定區(qū)(Interferon sensitivity determi

7、ning region,ISDR)。他們認為野生型株(HCV J)為耐干擾素株,其他病毒株的ISDR序列如與之相同則為野生株,會對IFN無應(yīng)答；如與野生型株ISDR序列相差4個氨基酸以上為突變株,對IFN持續(xù)應(yīng)答；差別在1～3個氨基酸之間為中間型,以無應(yīng)答為主。隨后日本學(xué)者的系列研究證實了這個發(fā)現(xiàn)。M Pascu等進行Meta分析認為:ISDR氨基酸殘基突變在HCV1b型患者中可以做為一個亞型用于預(yù)測IFN治療的應(yīng)答反應(yīng),可用于預(yù)測IF

8、N治療療效。
　　 然而有關(guān)ISDR國內(nèi)是否可做為HCV治療的預(yù)測因素仍存在爭議。唐振亞等對武漢地區(qū)12例IFN治療患者進行研究,認為中國分離株ISDR高度保守,中國的野生株對干擾素治療產(chǎn)生SVR；胡蕓文等發(fā)現(xiàn)上海丙型肝炎患者血清HCV的ISDR序列相對保守,干擾素治療前24份血清HCV病毒株均為ISDR野生型株和中間型株,未發(fā)現(xiàn)突變株,認為國內(nèi)少見ISDR氨基酸殘基突變,ISDR不能做為療效預(yù)測因素。然而,他們的研究對象為普通

9、干擾素治療患者,樣本量過小,未進行統(tǒng)計分析；而Shen等對江蘇地區(qū)應(yīng)用IFN治療的20例患者進行回顧性分析,認為ISDR氨基酸殘基突變影響干擾素治療療效,Yen等對及臺灣地區(qū)應(yīng)用Peg-IFN聯(lián)合RBV治療的60例患者ISDR氨基酸殘基突變與SVR顯著相關(guān)。國內(nèi)有關(guān)Peg-IFN聯(lián)合RBV治療的HCV1b慢性丙型病毒性肝炎ISDR氨基酸殘基突變的研究尚未見報道。
　　 本研究主要從影響療效的HCV病毒學(xué)因素方面進行研究,包括以下

10、三部分組成:
　　 1.采用RDH法建立HCV基因分型技術(shù)；
　　 2.建立一種以HCV1b型ISDR特異性引物為基礎(chǔ)的RT-PCR法,對廣東地區(qū)HCV ISDR進行序列測定,了解廣東地區(qū)ISDR氨基酸殘基突變的分布情況；
　　 3.回顧性分析ISDR及治療前、隨訪后等臨床資料,分析ISDR氨基酸殘基突變對Peg-IFN聯(lián)合RBV治療1b亞型CHC的影響因素,探討影響SVR的主要預(yù)測因素及ISDR的臨床意義。具體

11、內(nèi)容如下:
　　 一、反向點雜交技術(shù)檢測丙型肝炎病毒基因型的方法建立與應(yīng)用
　　 目的:建立HCV基因分型技術(shù)PCR-反向點雜交法(PCR-RDH)。
　　 方法:應(yīng)用生物信息學(xué)軟件針對HCV5’端非編碼區(qū)(5’UTR)和核心蛋白區(qū)(C)設(shè)計特異性捕獲探針及生物素標記引物,建立HCV基因分型的PCR-反向點雜交技術(shù)。應(yīng)用本技術(shù)對115份丙肝血清標本進行基因型和基因亞型檢測,同時對其中38份標本中的HCV進行RT-

12、PCR基因擴增、測序、系統(tǒng)進化樹分析確實HCV基因型和亞型,以評價反向點雜交法的準確性及臨床應(yīng)用價值。
　　 結(jié)果:115份血清標本中,反向點雜交法基因型及基因亞型檢出率為96.5％(111/115),15份陰性對照全部為陰性。111例基因型明確標本中1b型63例(56.8％)；2a型9例(8.1％)；3a型4例(3.6％),3b型6例(5.4％)；6a型28例(25.2％),1b/2a混合型1例(0.9％)。經(jīng)測序分型確定此法

13、檢測準確度為100％,特異性為100％。HCV基因型反向點雜交法檢測準確可靠、簡單經(jīng)濟、高效,適用于臨床檢測。與10余年前研究相比,目前廣東地區(qū)的HCV基因型分布仍以1b型為主,但呈現(xiàn)出1b型比例下降,3a、6a型比例升高的趨勢。
　　 二、HCV1b型ISDR的檢測方法的建立
　　 目的:建立一種以HCV1b型ISDR特異性引物為基礎(chǔ)的RT—PCR方法,對廣東地區(qū)HCV ISDR進行序列測定,了解廣東地區(qū)ISDR氨基酸

14、殘基突變的分布情況。
　　 方法:根據(jù)已知GenBank中的HCV1b基因型D90208的全長序列及參考文獻設(shè)設(shè)計HCV1b NS5A ISDR引物序列,選擇南方醫(yī)院感染內(nèi)科門診就診和住院的55例HCV1b型慢性丙型肝炎患者的血清提取HCV RNA,采用巢式PT-PCR,擴增HCV1b NS5A的ISDR,并與HCV J株進行序列比對確定ISDR區(qū)氨基酸殘基突變數(shù)目,分析廣東地區(qū)HCV1b型患者ISDR分布情況。
　　

15、結(jié)果:HCV ISDR區(qū)擴增產(chǎn)物全長249bp,電泳顯示條帶清晰,大小符合預(yù)期分子量,無非特異性條帶擴增,測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析為目的片段。廣東地區(qū)HCV1b型ISDR分布為:ISDR野生株(無突變)占25.5％(14/55),中間型(突變數(shù)目1-3個)占72.7％(40/55),突變株(突變數(shù)目超過3個者)占1.8％(1/55)。
　　 三、ISDR變異對Peg-IFN bud聯(lián)合RBV治療1b亞型CHC療效的影響
　

16、　 目的:探討廣東地區(qū)HCV1b患者ISDR變異對Peg—IFN聯(lián)合RBV抗病毒治療的影響因素及臨床意義。
　　 方法:選擇經(jīng)ISDR檢測并接受Peg-IFN聯(lián)合RBV治療的HCV1b型CHC44例患者進行回顧性分析。
　　 結(jié)果:SVR率為43.2％(19/44),Peg—IFNα-2a組與Peg-IFNα-2b組SVR相比,兩者無統(tǒng)計學(xué)差異(P＝0.797)；ISDR氨基酸殘基突變數(shù)目≥2個與早期病毒學(xué)應(yīng)答及SVR

17、顯著相關(guān)(P＝0.018及P＝0.005),ISDR氨基酸殘基突變與EVR及SVR有統(tǒng)計學(xué)差異,而與ETVR無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.056)；在年齡組(年齡≤40歲)中,ISDR與年齡相關(guān)(P＝0.012),年齡小則ISDR突變數(shù)目多；ISDR與輸血及非輸血傳播途徑無關(guān)(P＝0.117)。；ISDR2218位氨基酸突變最多,在SVR組中突變中有14例(14/18,占77.8％),NR組中11例(11/15,占73.3％),無統(tǒng)計學(xué)差異(P

18、=0.767)。多因素Logistic回歸分析顯示:影響SVR的最主要因素是ISDR氨基酸殘基突變(OR=17.038,95％可信區(qū)間為:1.923～150.944,P＝0.011),其次是年齡≤40歲(OR=12.259,95％可信區(qū)間為:0.012～0.559,P=0.011),AST影響SVR(OR=1.021,95％可信區(qū)間為:1.003～1.039,P=0.020)。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究建立的PCR

19、-反向點雜交法對我國常見的HCV基因亞型1b、2a、3a、3b和6a檢測的準確性、特異性及靈敏度較好,適宜我國臨床推廣應(yīng)用；
　　 2.廣東地區(qū)的HCV基因型分布仍然以1b型多見,呈現(xiàn)出1b型比例下降,3a、6a型比例升高的趨勢；
　　 3.HCV ISDR區(qū)擴增順利,無非特異性條帶擴增,測序及BLAST分析為目的片段,方法可靠。廣東地區(qū)HCV1b型ISDR分布以野生株及中間株為主,多突變株比例較低(1.8％)；

20、　　 4.聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林治療廣東地區(qū)HCV1b型CHC患者SVR率為43.2％(19/44),Peg—IFNα-2a組與Peg-IFNα-2b組SVR相比無統(tǒng)計學(xué)差異；
　　 5.ISDR氨基酸殘基突變數(shù)目≥2個與早期病毒學(xué)應(yīng)答及SVR相關(guān)；ISDR氨基酸殘基突變與輸血及非輸血傳播途徑無關(guān)；
　　 6.廣東地區(qū)ISDR氨基酸殘基突變以2218位氨基酸突變居多,但對SVR的影響未見統(tǒng)計學(xué)差異,需擴大樣本深入研