AFB1對Cyp2a5敲除小鼠的急性肺損傷效應(yīng)研究.pdf

1、黃曲霉毒素B1(AFB1)是一種毒性極強的環(huán)境致癌物，以往研究已證實AFB1暴露能導(dǎo)致肝損傷、肝癌等肝臟疾病。職業(yè)人群特別是糧食加工場所空氣中存在AFB1污染，但其與呼吸系統(tǒng)疾病的關(guān)系鮮受關(guān)注。AFB1是間接致癌物，需要經(jīng)過CYP酶的代謝活化，并通過活性中間代謝產(chǎn)物如AFB1-endo-8，9-環(huán)氧化物才能發(fā)揮其致癌性及強毒性。CYP2A13作為表達在呼吸道內(nèi)的肝外代謝酶，本課題組以往發(fā)現(xiàn)CYP2A13能夠代謝活化AFB1并引起支氣管上

2、皮細胞損傷和惡性轉(zhuǎn)化，但與呼吸系統(tǒng)損傷的關(guān)系尚未證實。
　　小鼠體內(nèi)的CYP2A5是人類CYP2A13的同源代謝酶，其代謝AFB1的活性與CYP2A13較接近。本研究通過構(gòu)建cyp2a5敲除小鼠，利用氣管滴注AFB1染毒，比較敲除小鼠和野生型小鼠的肺組織損傷效應(yīng)、炎癥反應(yīng)及其主要類型，試圖解析CYP2A5在AFB1所致小鼠肺損傷中的重要作用，為系統(tǒng)探討CYP2A13對AFB1的代謝活化以及與人群呼吸系統(tǒng)疾病的關(guān)系提供實驗依據(jù)。

3、r>　　第一部分:Cyp2a5全身性敲除小鼠的構(gòu)建及鑒定
　　目的:
　　構(gòu)建Cyp2a5基因敲除(KO)小鼠，為后續(xù)研究提供動物模型。
　　方法:
　　構(gòu)建Cyp2a5基因打靶載體，通過電轉(zhuǎn)將打靶載體導(dǎo)入C57BL/6小鼠的ES細胞中，藥物篩選ES，經(jīng)PCR及Southern驗證Knockout ES細胞;經(jīng)顯微注射注射入囊胚中;將囊胚移植到代孕母鼠體內(nèi);生產(chǎn)出嵌合體小鼠后與野生型小鼠雜交獲得雜合子F1代Kno

4、ckout小鼠。F1代小鼠提取鼠尾DNA進行基因型鑒定，鑒定為陽性的互交擴大繁殖生成F2;F2代小鼠提取鼠尾DNA進行基因型鑒定，F(xiàn)2小鼠提取典型臟器的RNA進行RT-PCR驗證。
　　結(jié)果:
　　嵌合體小鼠與野生型小鼠雜交產(chǎn)生13只F1代小鼠，經(jīng)PCR鑒定有4♂和4♀為陽性;F1代小鼠互交產(chǎn)生25只F2代小鼠，其中11只鑒定為雜合子，6只為野生型WT，8只為KO純合子，符合遺傳定律，性別分配均衡，未發(fā)現(xiàn)有胚胎致死及發(fā)育缺陷

5、;F2代小鼠中WT小鼠其肺臟、肝臟、腎臟均有Cyp2a5的表達，而KO小鼠相應(yīng)臟器未發(fā)現(xiàn)Cyp2a5的表達，提示Cyp2a5敲除小鼠構(gòu)建成功。
　　第二部分:AFB1對Cyp2a5敲除小鼠急性肺損傷的效應(yīng)評價
　　目的:
　　研究CYP2A5在氣管滴注AFB1所致小鼠急性肺損傷中的作用，為闡明CYP2A13在職業(yè)場所AFB1空氣暴露與呼吸系統(tǒng)疾病關(guān)系中的作用提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　建立經(jīng)氣管滴注AF

6、B1染毒的動物模型，檢測WT小鼠和KO小鼠肺臟HE病理損傷程度、肺泡灌洗液(BALF)中乳酸脫氫酶(LDH)活性、總蛋白量、滲出細胞數(shù)量，評價兩種基因型小鼠的肺臟急性損傷程度;細胞涂片染色分析BALF中炎性細胞類型、免疫熒光分析肺組織中巨噬細胞的分布、芯片分析血清中炎癥相關(guān)的細胞因子，評價兩種基因型小鼠肺臟炎癥的發(fā)生程度及可能的機制。
　　結(jié)果:
　　低劑量（1mg/kg）AFB1暴露1天后，敲除小鼠肺泡灌洗液中LDH活性、

7、蛋白含量、總細胞計數(shù)均顯著低于野生型小鼠;隨著暴露時間的增加，效應(yīng)指標無顯著增加趨勢，而且兩種基因型小鼠效應(yīng)指標間無顯著差異。高劑量(10mg/kg) AFB1暴露后，隨著暴露時間的增加，WT小鼠肺泡灌洗液中LDH活性、蛋白含量、總細胞計數(shù)，病理損傷程度均呈顯著增加趨勢;在1、3、7天時間點敲除小鼠效應(yīng)指標均顯著低于野生型小鼠。高劑量（10mg/kg）AFB1暴露1天后，野生型小鼠血清中的IL-6含量顯著高于敲除小鼠;隨著暴露時間的增加

8、，巨噬細胞的數(shù)量及所占比重呈增加趨勢。
　　結(jié)論:
　　1.我們構(gòu)建并成功獲得了Cyp2a5敲除小鼠的純合子，該小鼠形狀可以遺傳后代;是我們探討主要表達在人體呼吸系統(tǒng)中的CYP2A13代謝酶對外源化學物（比如AFB1）代謝活化的良好模型。
　　2.呼吸道暴露AFB1可以引起急性肺損傷，并且引出炎癥反應(yīng):而在此過程中，小鼠肺臟內(nèi)CYP2A5對AFB1的代謝活化起重要作用
　　3.不同劑量的AFB1暴露毒效應(yīng)不同，1