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文檔簡介
1、糖皮質激素(Glucocorticoids,GCs)是腎上腺皮質分泌的一種重要的激素,參與了機體多種物質的代謝過程,對維持機體正常的生長發(fā)育及內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)等發(fā)揮重要的作用。同時糖皮質激素還具有很強的抗炎、免疫抑制等重要的藥理作用,是臨床常用的藥物。另外,糖皮質激素還是一種參與應激的重要激素。然而大量研究顯示,長期反復的應激或大劑量外源性糖皮質激素的給予可使體內GCs維持在較高水平,引起海馬神經元的丟失和死亡,與阿爾茨海默癥(AD)的發(fā)生
2、和發(fā)展密切相關。然而,體內高水平的糖皮質激素對海馬神經元損傷的機制還尚不完全清楚。
第一部分:
目的:
研究慢性糖皮質激素對原代培養(yǎng)海馬神經元NLRP-1炎癥小體激活的影響及機制,探討NLRP-1炎癥小體在慢性GCs誘導海馬神經元損傷的作用。
方法:
1.原代培養(yǎng)海馬神經元到第5天,隨機分成對照組和地塞米松(DEX,5μM)組,各組再分為1d、3d、5d三個時間點。LDH試劑盒檢測海馬神
3、經元細胞損傷情況;Hoechst33258染色測定海馬神經元凋亡情況;Western blot檢測NLRP-1、ASC、Caspase-1、IL-1β的蛋白表達變化;ELISA檢測細胞上清液中IL-1β、IL-18的含量變化。
2.原代培養(yǎng)海馬神經元到第5天,隨機分成6組:對照組,DEX(0.1,1,5μM)組,RU486(5μM)組和DEX(5μM)+RU486(5μM)組。LDH試劑盒檢測海馬神經元細胞損傷情況;Hoech
4、st33258染色測定海馬神經元凋亡情況;免疫熒光檢測GR和MAP2表達情況;Western blot檢測GR、ASC、NLRP-1、Caspase-1、IL-1β的蛋白表達變化;ELISA檢測細胞上清液中IL-1β、IL-18的含量變化;Q-PCR檢測NLRP-1、ASC、Caspase-1、IL-1β的mRNA表達變化情況。
結果:
1.與對照組比較,DEX5μM處理3、5d能明顯促進海馬神經元LDH的釋放;Ho
5、echst33258結果顯示,與對照組比較,DEX5μM處理1、3、5d能明顯促進海馬神經元凋亡,細胞核固縮或裂解呈碎塊狀;Western blot結果表明,與對照組比較,DEX5μM處理5d的海馬神經元細胞MAP2表達明顯下降,DEX5μM處理1、3d的海馬神經元細胞NLRP-1, caspase-1 and IL-1β表達明顯增加。
2.與對照組比較,DEX1、5μM處理3d能明顯增加細胞上清液中LDH的含量,而RU486
6、可抑制其增加。Hoechst33258結果顯示,與對照組比較,DEX5μM處理3d導致海馬神經元細胞凋亡明顯。免疫熒光結果顯示,與對照組比較,DEX1μM和5μM處理5d海馬神經元MAP2的表達明顯降低;DEX0.1,1和5μM處理3d能明顯減少海馬神經元GR的表達。Western blot結果表明,與對照組比較,DEX0.1,1和5μM處理3d能明顯減少海馬神經元GR的表達以及明顯增加NLRP-1和ASC的表達;DEX0.1μM處理3
7、d能明顯減少海馬神經元caspase-1和IL-1β的表達,DEX5μM處理3d的海馬神經元caspase-1和IL-1β表達明顯增加;DEX1μM和5μM處理3d可明顯下調海馬神經元NF-κB的表達;與DEX5μM組比較,RU486能明顯抑制DEX誘導的海馬神經元caspase-1和IL-1β表達增高。ELISA結果表明,與對照組比較,DEX1和5μM處理3d能明顯增加海馬神經元細胞上清液中IL-1β和IL-18的含量,而RU486能
8、明顯減少IL-1β和IL-18的釋放。
第二部分:
目的:
研究慢性糖皮質激素對海馬神經元 BK-NLRP1信號通路的影響,探討B(tài)K-NLRP1信號通路在糖皮質激素誘導海馬神經元損傷中的作用,以便為AD的防治提供新的思路和靶點。
方法:
1.原代培養(yǎng)海馬神經元到第5天,隨機分成4組:對照組,DEX(5μM)組,Iberiotoxin(IbTx,0.2μM)組和DEX(5μM)+IbTx(
9、0.2μM)組。LDH試劑盒檢測海馬神經元細胞損傷情況;Hoechst33258染色測定海馬神經元凋亡情況;免疫熒光檢測 MAP-2蛋白表達的變化;Western blot檢測MAP2、BK、NLRP-1、ASC、Caspase-1、IL-1β的蛋白表達變化;ELISA檢測細胞上清液中IL-1β、IL-18的含量變化;Q-PCR檢測NLRP-1、ASC、Caspase-1、IL-1β的 mRNA表達變化;采用離子選擇電極法檢測海馬神經元
10、細胞內鉀離子的濃度;全細胞膜片鉗方法觀察DEX和IbTx對海馬神經元大電導鈣激活鉀通道(large conductance calcium activated potassium channel channel, BK)電流變化的影響。
2.雄性小鼠分為對照組,DEX(5mg/kg)組,各組再分為7d、14d、21d、28d四個時點。Western blot和Q-PCR檢測小鼠海馬組織中BK mRNA和蛋白表達水平。
11、 結果:
1.與對照組比較,IbTx能明顯減少 DEX誘導海馬神經元的 LDH釋放;IbTx也能抑制DEX誘導海馬神經元的凋亡。Western blot結果表明,與DEX5μM組比較,IbTx能明顯減少DEX誘導海馬神經元NLRP1, ASC, caspase-1和IL-1β的表達。免疫熒光結果顯示,與DEX5μM組比較,IbTx能明顯減少DEX誘導海馬神經元的MAP2的表達。ELISA結果表明,與DEX5μM組比較,IbTx
12、能明顯抑制海馬神經元細胞上清液中IL-1β和IL-18的釋放。全細胞膜片鉗結果顯示,DEX(5μM)可以增大海馬神經元BK通道電流大小,降低細胞內鉀離子的濃度,IbTx可抑制這一效應。
2. Western blot結果顯示,與對照組比較,DEX5mg/kg處理7,21和28天小鼠海馬和皮層組織內 BK表達明顯增加。Q-PCR結果顯示,與對照組比較,DEX5mg/kg處理21天和28天小鼠皮層和海馬組織內BK表達水平明顯增加。
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