地五養(yǎng)肝膠囊對(duì)Solt-Farber二步法肝癌大鼠模型的肝癌發(fā)生發(fā)展的影響及其機(jī)制.pdf

1、目的：研究基于骨髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)化肝癌干細(xì)胞的肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，闡明體現(xiàn)“補(bǔ)腎生髓成肝”治療法則的地五養(yǎng)肝膠囊對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的影響及其機(jī)制，豐富“肝主生發(fā)”（“髓生肝”、“髓失生肝”、“補(bǔ)腎生髓成肝”）的科學(xué)內(nèi)涵。
　　方法：（1）80只4-5周齡的雄性SPF級(jí)SD大鼠,按隨機(jī)數(shù)字法分為模型組(Model)、索拉非尼組(Sorafenib)、地五養(yǎng)肝治療組(DWYG)、細(xì)胞對(duì)照組(BMSC)、空白對(duì)照組(Normal)，每組16只。室內(nèi)

2、清潔消毒后，加飼料及水適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始造模，用Solt-Farber二步法建立肝癌大鼠模型，具體方法如下：即造模第一天，模型組、索拉非尼組、地五養(yǎng)肝治療組按50mg/kg的劑量一次性腹腔注射（Intraperitoneal,ip）二乙基亞硝胺（Diethylmitrosamine，DEN）作為啟動(dòng)劑，2周后均按15mg/kg/d劑量予以二乙酰氨基芴(2-Acetylaminofluorene，2-AAF)灌胃(Intragastri

3、cal administration,ig)7天，第3周末行2/3肝部分切除術(shù)（Partial hepatectomy，PHx），切除肝左葉和中葉，并將紅色熒光蛋白標(biāo)記的骨髓干細(xì)胞（Red fluorescent protein-bone stem cells，RFP-BMSCs）種植于大鼠肝右葉的12點(diǎn)、3點(diǎn)、6點(diǎn)、9點(diǎn)和中心點(diǎn)位置，每個(gè)點(diǎn)注射0.1ml RFP-BMSCs（約105個(gè)細(xì)胞），分層縫合。細(xì)胞對(duì)照組不做肝切除術(shù)僅移植RF

4、P-BMSCs于大鼠肝右葉。地五養(yǎng)肝治療組于造模期間按750mg/kg/d劑量給予地五養(yǎng)肝膠囊水溶液(DWYG)灌胃，索拉非尼組按80mg/kg/d劑量給予索拉非尼溶液(Sorafenib)灌胃，模型組、細(xì)胞對(duì)照組、空白對(duì)照組則給予等量生理鹽水(Normal saline)灌胃對(duì)照。手術(shù)4天起給予對(duì)應(yīng)的藥物灌胃16周。
　　即模型組（DEN ip+2-AAF ig+PHx+RFP-BMSCs+NS ig）、索拉非尼組（DEN ip

5、+2-AAFig+PHx+RFP-BMSCs+Sorafenib ig）、地五養(yǎng)肝治療組（DEN ip+2-AAFig+PHx+RFP-BMSCs+DWYG ig）、細(xì)胞對(duì)照組（NS ip+RFP-BMSCs+NS ig）、空白對(duì)照組（NS ip+NS ig）。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死各組實(shí)驗(yàn)大鼠，切取實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織以4％多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，做厚5μm的連續(xù)切片，蘇木精-伊紅染色（Hematoxylin-eosin stain

6、ing，HE）進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)，并于每組內(nèi)每張切片隨機(jī)挑選3-4個(gè)400倍視野，采用記分法進(jìn)行半定量分析評(píng)估每個(gè)視野中肝癌的病理程度。根據(jù)Edmondson-Steiner分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和陽(yáng)性細(xì)胞百分比分別計(jì)分，以各組平均積分分析不同組中大鼠肝癌病理程度。切取實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織以 Carnoy’s固定液固定(無(wú)水乙醇:冰乙酸=3:l)做厚5μm的連續(xù)切片，F(xiàn)eulgen染色進(jìn)行肝細(xì)胞核DNA含量檢測(cè)。免疫組織化學(xué)染色法以檢測(cè)肝組織PCNA、AB

7、CG2、CD34、Thy-1的表達(dá)。采用免疫熒光法檢測(cè)肝組織中骨髓干細(xì)胞和肝癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物 ABCG2/CD34、ABCG2/CD45、ABCG2/Thy-1的表達(dá)。切取大鼠肝組織以液氮凍存。蛋白印跡雜交技術(shù)（Western Blot）檢測(cè)肝組織中EMT相關(guān)E-cadherin、Vimentin、TGF-β1的表達(dá)，檢測(cè)Ras/Raf/Mek/Erk、JAK/STAT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse Tr

8、anscription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）檢測(cè)E-cadherin、Vimentin、Ras/Raf/Mek/Erk、JAK/STAT信號(hào)通路相關(guān) mRNA的表達(dá)。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,結(jié)果均以 Mean±SD（均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差）表示。多組之間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1肉

9、眼觀察肝臟大體形態(tài)：空白對(duì)照組肝臟形態(tài)正常，表面光滑，邊緣銳利，質(zhì)軟。模型組和空白對(duì)照組比較，可見肝臟形態(tài)不規(guī)則，肝葉不全，表面粗糙，凸凹不平，質(zhì)地較硬，表面和切面呈彌漫性肝結(jié)節(jié)，大小不等，或可見出血、壞死等特征。經(jīng)索拉非尼、地五養(yǎng)肝膠囊治療后上述病理表現(xiàn)明顯減輕。
　　2組織病理學(xué)結(jié)果（HE染色）:空白對(duì)照組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，排列整齊，胞膜完整，胞核清晰。模型組和空白對(duì)照組比較，可見腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞密度大，肝細(xì)胞索排列紊

10、亂，核質(zhì)比大，核染色深，或核異型，伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理特征。和模型組比較，經(jīng)索拉非尼、地五養(yǎng)肝膠囊治療后上述病理變化明顯減輕。細(xì)胞對(duì)照組部分可見炎性細(xì)胞小灶。
　　采用記分法半定量分析各組大鼠肝癌病理程度，結(jié)果顯示：模型組的平均積分（10.90±2.71）明顯高于空白對(duì)照組（0.00±0.00），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；地五養(yǎng)肝治療組的平均積分（8.00±2.43）低于模型組（10.90±2.71），差異有

11、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；索拉非尼組的平均積分（8.20±3.11）亦低于模型組（10.90±2.71），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；地五養(yǎng)肝治療組(8.00±2.43)和索拉非尼組(8.20±3.11)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　3地五養(yǎng)肝膠囊對(duì)肝細(xì)胞核 DNA含量的影響（Feulgen染色法）：模型組(14297.24±620.84) IOD值明顯高于空白對(duì)照組(2901.33±84.64)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分

12、析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);地五養(yǎng)肝治療組（8554.73±135.86） IOD值低于模型組(14297.24±620.84)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；索拉非尼組（8965.99±338.65） IOD值亦低于模型組(14297.24±620.84)，p<0.05；地五養(yǎng)肝治療組（8554.73±135.86）IOD值低于索拉非尼組（8965.99±338.65），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；空白對(duì)照組(290

13、1.33±84.64)和細(xì)胞對(duì)照組（3346.42±181.37）比較,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。
　　4地五養(yǎng)肝膠囊對(duì)PCNA（Proliferating Cell Nuclear Antigen,增殖細(xì)胞核抗原）表達(dá)的影響（免疫組織化學(xué)法）：模型組(0.5790±0.0303)OD值明顯高于空白對(duì)照組(0.2821±0.0138),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);地五養(yǎng)肝治療組（0.4397±0.0181） OD值明顯低

14、于模型組(0.5790±0.0303)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；索拉非尼組（0.4553±0.0208）PCNA的表達(dá)亦低于模型組(0.5790±0.0303)，p<0.05；地五養(yǎng)肝治療組（0.4397±0.0181）和索拉非尼組（0.4553±0.0208）之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）；空白對(duì)照組(0.2821±0.0138)和細(xì)胞對(duì)照組（0.2934±0.0223）比較,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。
　　

15、5地五養(yǎng)肝膠囊對(duì)肝癌干細(xì)胞的影響
　　(1)地五養(yǎng)肝膠囊對(duì)骨髓干細(xì)胞和肝癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物 ABCG2、CD34、Thy-1雙陽(yáng)性表達(dá)的影響(免疫組織化學(xué)法)：
　　免疫組織化學(xué)染色對(duì)ABCG2表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果顯示：模型組ABCG2的表達(dá)（0.3276±0.0210）明顯高于空白對(duì)照組（0.1930±0.0045），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）;地五養(yǎng)肝治療組（0.2423±0.0144） OD值明顯低于模型

16、組(0.3276±0.0210)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；索拉非尼組（0.2514±0.0203） ABCG2的表達(dá)亦低于模型組(0.3276±0.0210)，p<0.05；地五養(yǎng)肝治療組（0.2423±0.0144）和索拉非尼組（0.2514±0.0203）之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）；空白對(duì)照組(0.1930±0.0045)和細(xì)胞對(duì)照組（0.1964±0.0126）比較,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。
　　免

17、疫組織化學(xué)染色對(duì)CD34表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果顯示：模型組CD34的表達(dá)（0.5880±0.0290）明顯高于空白對(duì)照組（0.4077±0.0086），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);地五養(yǎng)肝治療組（0.4857±0.0312） OD值明顯低于模型組（0.5880±0.0290），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；索拉非尼組（0.4648±0.0239） CD34的表達(dá)亦低于模型組(0.5880±0.0290)，p<0.05；地五

18、養(yǎng)肝治療組（0.4857±0.0312）和索拉非尼組（0.4648±0.0239）之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）；空白對(duì)照組(0.4077±0.0086)和細(xì)胞對(duì)照組（0.3980±0.0098）比較,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。
　　免疫組織化學(xué)染色對(duì)Thy-1表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果顯示：模型組Thy-1的表達(dá)（0.5887±0.0361）明顯高于空白對(duì)照組（0.4121±0.0134），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0

19、.05);地五養(yǎng)肝治療組（0.4787±0.0228） OD值明顯低于模型組（0.5887±0.0361），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；索拉非尼組（0.4790±0.0274） Thy-1的表達(dá)亦低于模型組(0.5887±0.0361)，p<0.05；地五養(yǎng)肝治療組（0.4787±0.0228）和索拉非尼組（0.4790±0.0274）之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）；空白對(duì)照組(0.4121±0.0134)和細(xì)胞對(duì)照組（0.

20、4085±0.0220）比較,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。
　　(2)地五養(yǎng)肝膠囊對(duì)骨髓干細(xì)胞及肝癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物雙陽(yáng)性表達(dá)的影響(免疫熒光法)：
　　模型組、索拉非尼組和地五養(yǎng)肝治療組中ABCG2/CD34、ABCG2/CD45、ABCG2/Thy-1呈雙陽(yáng)性表達(dá)。模型組 ABCG2/CD34的雙陽(yáng)性熒光表達(dá)（0.3136±0.0294）明顯高于空白對(duì)照組（0.1954±0.0110），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

21、p<0.05);地五養(yǎng)肝治療組（0.2188±0.0114） ABCG2/CD34的雙陽(yáng)性表達(dá)明顯低于模型組（0.3136±0.0294），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；索拉非尼組（0.2359±0.0179）ABCG2/CD34的雙陽(yáng)性表達(dá)亦低于模型組(0.3136±0.0294)，p<0.05；地五養(yǎng)肝治療組（0.2188±0.0114）和索拉非尼組（0.2359±0.0179）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）；空白對(duì)照組(

22、0.1954±0.0110)和細(xì)胞對(duì)照組（0.1944±0.0066）比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。
　　模型組ABCG2/CD45的雙陽(yáng)性熒光表達(dá)（0.3089±0.0113）明顯高于空白對(duì)照組（0.1996±0.0104），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);地五養(yǎng)肝治療組（0.2377±0.0163）ABCG2/CD45的雙陽(yáng)性表達(dá)明顯低于模型組（0.3089±0.0113），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.0

23、5）；索拉非尼組（0.2328±0.0157） ABCG2/CD34的雙陽(yáng)性表達(dá)亦低于模型組(0.3089±0.0113)，p<0.05；地五養(yǎng)肝治療組（0.2377±0.0163）和索拉非尼組（0.2328±0.0157）之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）；空白對(duì)照組(0.1996±0.0104)和細(xì)胞對(duì)照組（0.1891±0.0090）比較,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。
　　模型組ABCG2/Thy-1的雙陽(yáng)性熒光表達(dá)（

24、0.2953±0.0146）明顯高于空白對(duì)照組（0.1995±0.0082），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);地五養(yǎng)肝治療組（0.2320±0.0148）ABCG2/Thy-1的雙陽(yáng)性表達(dá)明顯低于模型組（0.2953±0.0146），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；索拉非尼組（0.2458±0.01360） ABCG2/CD34的雙陽(yáng)性表達(dá)亦低于模型組(0.2953±0.0146)，p<0.05；地五養(yǎng)肝治療組（0.23

25、20±0.0148）和索拉非尼組（0.2458±0.01360）之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）；空白對(duì)照組(0.1995±0.0082)和細(xì)胞對(duì)照組（0.1980±0.0076）比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。
　　6地五養(yǎng)肝膠囊對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制相關(guān)指標(biāo)的影響
　　(1)地五養(yǎng)肝膠囊對(duì)EMT相關(guān)指標(biāo)的影響：
　　Western Blot檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物結(jié)果顯示:模型組（0.35±0.03）的上皮

26、細(xì)胞標(biāo)志物 E-cadherin蛋白表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組(1.16±0.10),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);地五養(yǎng)肝治療組（0.72±0.04）E-cadherin蛋白表達(dá)明顯高于模型組（0.35±0.03），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；地五養(yǎng)肝治療組（0.72±0.04）和索拉非尼組（0.62±0.07）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）；空白對(duì)照組(1.16±0.10)和細(xì)胞對(duì)照組(1.22±0.09)

27、比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　模型組間皮細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin蛋白的表達(dá)（1.52±0.06）明顯高于空白對(duì)照組（0.36±0.03），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);地五養(yǎng)肝治療組（0.93±0.08） Vimentin蛋白的表達(dá)明顯低于模型組（1.52±0.06），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；地五養(yǎng)肝治療組（0.93±0.08）和索拉非尼組（1.08±0.11）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p

28、<0.05）；空白對(duì)照組(0.36±0.03)和細(xì)胞對(duì)照組(0.33±0.01)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　模型組中對(duì)EMT起重要調(diào)節(jié)作用的TGF-β1蛋白的表達(dá)（1.76±0.10）明顯高于空白對(duì)照組（0.43±0.04），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);地五養(yǎng)肝治療組（0.93±0.05）TGF-β1蛋白的表達(dá)明顯低于模型組（1.76±0.10），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；細(xì)胞對(duì)照組（0

29、.30±0.03）和空白對(duì)照組（0.43±0.04）比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；地五養(yǎng)肝治療組（0.93±0.05）和索拉非尼組（0.93±0.03）相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）；空白對(duì)照組(0.43±0.04)和細(xì)胞對(duì)照組(0.30±0.03)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　RT-PCR結(jié)果顯示:模型組的上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin mRNA表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,差異顯著(p

30、<0.05)；地五養(yǎng)肝治療組E-cadherin mRNA的表達(dá)明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；而間皮細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin mRNA表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,p<0.05；地五養(yǎng)肝治療組Vimentin mRNA的表達(dá)明顯低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；地五養(yǎng)肝治療組E-cadherin和Vimentin mRNA的表達(dá)與索拉非尼組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 p>0.05；空白對(duì)照組和細(xì)胞對(duì)

31、照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　(2)地五養(yǎng)肝膠囊對(duì)Ras/Raf/Mek/Erk通路相關(guān)指標(biāo)的影響：
　　Western Blot結(jié)果顯示模型組Raf-1（0.91±0.05）蛋白的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組（0.40±0.05）,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);地五養(yǎng)肝治療組（0.79±0.02）Raf-1、蛋白表達(dá)明顯低于模型組（0.91±0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；地五養(yǎng)

32、肝治療組（0.79±0.02）Raf-1蛋白的表達(dá)與索拉非尼組（0.77±0.05）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）；空白對(duì)照組(0.40±0.05)和細(xì)胞對(duì)照組(0.36±0.04)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　Mek1（1.81±0.10）蛋白的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組（0.70±0.03）,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);地五養(yǎng)肝治療組（1.10±0.05）Mek1蛋白表達(dá)明顯低于模型組（

33、1.81±0.10），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；地五養(yǎng)肝治療組Mek1蛋白(1.10±0.05)的表達(dá)低于索拉非尼組(1.25±0.05)，p<0.05；空白對(duì)照組(0.70±0.03)和細(xì)胞對(duì)照組(0.72±0.06)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　Erk1（1.49±0.04）蛋白的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組（0.55±0.11）,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);地五養(yǎng)肝治療組（0.95±0.0

34、9）Erk1蛋白表達(dá)明顯低于模型組（1.49±0.04），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；地五養(yǎng)肝治療組（0.95±0.09）Erk1蛋白的表達(dá)與索拉非尼組（0.98±0.08）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）；空白對(duì)照組(0.55±0.11)和細(xì)胞對(duì)照組(0.53±0.12)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　模型組 VEGF（2.31±0.15）蛋白的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組（0.59±0.05）,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，

35、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);地五養(yǎng)肝治療組（1.76±0.24）VEGF蛋白表達(dá)明顯低于模型組（2.31±0.15），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；地五養(yǎng)肝治療組（1.76±0.24）VEGF蛋白的表達(dá)與索拉非尼組（1.66±0.13）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）；空白對(duì)照組(0.59±0.05)和細(xì)胞對(duì)照組(0.77±0.07)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　RT-PCR結(jié)果顯示：模型組Raf-1

36、、Mek1、Erk1 mRNA的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，p<0.05；與模型組比較，地五養(yǎng)肝治療組中Raf-1、Mek1、Erk1 mRNA的表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；索拉非尼組Raf-1、Mek1、Erk1 mRNA表達(dá)亦低于模型組，p<0.05；地五養(yǎng)肝治療組與索拉非尼組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；空白對(duì)照組和細(xì)胞對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　(3)地五養(yǎng)肝膠囊對(duì)JAK/ST

37、AT通路相關(guān)指標(biāo)的影響：
　　模型組（1.40±0.04）JAK2蛋白的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組（0.47±0.03），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，p<0.05。地五養(yǎng)肝治療組 JAK2的表達(dá)（1.01±0.05）顯著下調(diào)，與模型組（1.40±0.04）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.05；地五養(yǎng)肝治療組（1.01±0.05）JAK2蛋白的表達(dá)與索拉非尼組（1.12±0.09）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；空白對(duì)照組(0.47±0.03

38、)和細(xì)胞對(duì)照組(0.49±0.04)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　模型組（1.27±0.09）STAT3蛋白的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組（0.44±0.06），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，p<0.05；地五養(yǎng)肝治療組STAT3的表達(dá)（0.85±0.03）顯著下調(diào)，與模型組（1.27±0.09）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.05；地五養(yǎng)肝治療組（0.85±0.03）STAT3蛋白的表達(dá)與索拉非尼組（0.96±0.08）比較，差異無(wú)統(tǒng)

39、計(jì)學(xué)意義（p>0.05）；空白對(duì)照組(0.44±0.06)和細(xì)胞對(duì)照組(0.40±0.09)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　模型組（1.58±0.04）STAT5蛋白的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組（0.63±0.04），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，p<0.05；地五養(yǎng)肝治療組STAT5的表達(dá)（0.95±0.09）顯著下調(diào)，與模型組（1.58±0.04）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.05；地五養(yǎng)肝治療組（0.95±0.09）STAT5蛋

40、白的表達(dá)與索拉非尼組（1.10±0.15）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）；空白對(duì)照組(0.63±0.04)和細(xì)胞對(duì)照組(0.62±0.05)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　RT-PCR結(jié)果顯示：模型組JAK2、STAT3的mRNA表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.05；地五養(yǎng)肝治療組JAK2、STAT3的表達(dá)顯著下調(diào)，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；索拉非尼組JAK2、STAT

41、3 mRNA表達(dá)亦低于模型組，p<0.05；地五養(yǎng)肝治療組JAK2mRNA表達(dá)低于索拉非尼組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；空白對(duì)照組和細(xì)胞對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1地五養(yǎng)肝膠囊在一定程度上抑制了Solt-Farber二步法肝癌大鼠模型的肝癌發(fā)生發(fā)展，其效果不低于索拉非尼。
　　2骨髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)化肝癌干細(xì)胞參與肝癌發(fā)生發(fā)展是“髓失生肝”的生物學(xué)基礎(chǔ)。骨髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)化肝干細(xì)胞參與肝

42、再生修復(fù)是“髓生肝”的生物學(xué)基礎(chǔ)。體現(xiàn)“補(bǔ)腎生髓成肝”治療法則的地五養(yǎng)肝膠囊具有抑制“髓失生肝”、促進(jìn)“髓生肝”的作用。該研究豐富了“髓失生肝/髓生肝”的科學(xué)內(nèi)涵。
　　3體現(xiàn)“補(bǔ)腎生髓成肝”治療法則的地五養(yǎng)肝膠囊通過改善肝再生的微環(huán)境從而延緩肝癌發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程，其可能作用機(jī)制如下：（1）抑制“髓失生肝”、促進(jìn)“髓生肝”；（2）通過調(diào)控EMT/MET失衡，抑制EMT，促進(jìn)MET；（3）通過調(diào)節(jié)JAK/STAT信號(hào)通路；（4）通過調(diào)