脈沖超聲聯(lián)合微泡對在體不同級別微血管損傷作用的實驗研究.pdf

1、背景：
　　超聲波既可以用于人體疾病的診斷，又可作為一種能量形式用于疾病的治療。超聲造影劑是一種由氣體填充，脂質(zhì)體或蛋白質(zhì)包裹的微泡（一般直徑在1-10μm）。微泡能有效地增強心肌、肝、腎、腦等實質(zhì)器官的二維灰階和多普勒血流信號，可監(jiān)測器官內(nèi)的血流灌注情況，明顯提高超聲診斷的敏感性和特異性，已在臨床得到廣泛應(yīng)用。診斷超聲（2.3MHz，MI值為0.4）聯(lián)合微泡對細胞也有一定的損傷作用，會引起紅細胞外滲以及細胞死亡。這個結(jié)果明確顯示

2、了診斷超聲聯(lián)合微泡的生物效應(yīng)，雖然對活體的參數(shù)設(shè)定不是很明確。超聲聯(lián)合微泡的治療雖然仍處于實驗研究階段，但其臨床應(yīng)用潛力巨大，是近幾年超聲醫(yī)學研究的熱點。微泡經(jīng)靜脈注入血管后，由于微泡直徑的限制，難以滲透到組織間隙，其治療效應(yīng)主要作用于血管壁。超聲聯(lián)合微泡對正常微小血管的損傷作用主要表現(xiàn)為內(nèi)皮細胞的形態(tài)改變、壞死和脫落，基底膜斷裂和小動靜脈內(nèi)血栓形成等。超聲聯(lián)合微泡技術(shù)已用于基因治療、溶栓治療、藥物輸送、腫瘤物理治療、創(chuàng)傷止血、干細胞移

3、植等方面的實驗研究。
　　超聲聯(lián)合微泡既可以斷開細胞間緊密的連接，也可以增加物質(zhì)的跨細胞運輸，空化效應(yīng)是其主要機制。在不同條件下，其對血管的損傷程度不同，頻率為1MHz，聲壓為0.8MPa時會產(chǎn)生血管炎癥，而聲壓為2.0MPa時則有明顯的血管內(nèi)皮損傷。在超聲的作用下，微泡振蕩產(chǎn)生的微流、周期性的收縮與膨脹產(chǎn)生的作用力以及微泡破裂產(chǎn)生的微射流作用可對附近的血管壁產(chǎn)生輕微損傷,這種損傷在一定程度上增加了血管的通透性。超聲生物學效應(yīng)可改

4、變細胞膜通透性，有利于藥物/基因的跨胞膜遞送。
　　超聲聯(lián)合微泡在基因治療方面的研究發(fā)展迅速，主要應(yīng)用于皮膚、心臟、胰腺、腎臟、骨骼肌以及腫瘤組織?；蜣D(zhuǎn)染或藥物傳輸?shù)淖罴褩l件是能最大限度地增加細胞膜通透性，又不造成細胞膜的不可逆損傷，且超聲輻照攜帶基因或載藥微泡，廣州醫(yī)科大學碩士學位論文
　　可靶向特異組織釋放出基因或藥物。低頻超聲可增強藥物的經(jīng)皮滲透，主要機制是超聲作用于皮膚間的本身存在的空泡，產(chǎn)生空化效應(yīng)，使細胞間產(chǎn)生

5、空隙，皮膚上皮層分散，從而使小分子藥物通過。
　　超聲聯(lián)合微泡對血管可以產(chǎn)生嚴重或不可逆性的損傷作用。血管毀損術(shù)(Angiotripsy)是指將微泡造影劑注入靜脈，在較低的平均聲強下進行超聲輻照，對微血管產(chǎn)生一定的損毀作用，而治療區(qū)域沒有明顯的熱效應(yīng)。微泡經(jīng)靜脈注入血管后，由于微泡直徑的限制，難以滲透到組織間隙，損傷作用主要發(fā)生在微小血管，超聲輻照區(qū)域的微血管破壞，使組織局部微循環(huán)血供停止而達到治療的目的。以上述研究為基礎(chǔ)，本實驗

6、研究在一定治療參數(shù)下對腸壁及腸系膜不同內(nèi)徑血管損傷程度的不同。
　　目的：
　　超聲聯(lián)合微泡誘發(fā)血管損傷在過去幾年中被廣泛研究，但機制研究較缺乏，多數(shù)是在離體細胞水平或者模擬血管，以細胞水平的研究為主。超聲聯(lián)合微泡對細胞產(chǎn)生的聲孔效應(yīng)可在細胞膜上發(fā)現(xiàn)小孔并可測量孔徑，有研究成功將熒光分子直接通過細胞膜上形成的小孔進入細胞質(zhì)，而細胞仍可保持生物活性。這幾年隨著攝像技術(shù)的發(fā)展，使用高速攝像顯微鏡觀察單個微泡空化效應(yīng)對內(nèi)皮細胞膜的

7、損傷，從而研究超聲激勵的微泡對細胞的作用機制，研究著重在穩(wěn)態(tài)空化的作用，對于血管造成的是輕微的可逆的損傷作用。雖然先前研究結(jié)果顯示，超聲聯(lián)合微泡對血管的嚴重損傷在腫瘤治療、實質(zhì)臟器的創(chuàng)傷止血等方面具有較好的應(yīng)用前景，但沒有實時觀察對在體血管的損傷過程，對血管損傷的機制方面也缺乏研究。本文主要研究超聲聯(lián)合微泡在體腸壁上的毛細血管及腸系膜動靜脈微血管的損傷作用，并且對血管損傷程度進行分類，更直觀的觀察低頻高負值峰壓超聲誘導(dǎo)微泡對在體微血管的

8、直接損傷作用。
　　方法：
　　健康新西蘭大白兔20只，質(zhì)量約2.0-2.5kg。所有實驗大白兔術(shù)前禁食12h，可自由飲水。將其中2只大白兔設(shè)為空白組，余18只設(shè)為實驗組。實驗用新西蘭大白兔先使用速眠新Ⅱ注射液（由吉林省敦化市圣達動物藥品有限公司生產(chǎn)）0.2ml/kg進行肌肉注射，等待兔子初步麻醉后，使用21G針管插入實驗兔左耳的耳緣靜脈建立靜脈通道，使用2.5％戊巴比妥鈉（1.0ml/kg）麻醉。
　　室溫保持恒定，

9、濕度在40-60%之間，并且維持動物在深度麻醉下進行實驗，實驗兔仰臥位固定后，中下腹備皮，沿腹白線開腹，將部分小腸拉出體外，兔子側(cè)臥位擺放，選擇一段腸系膜血管進入腸壁分支較多的腸管（大約5cm）固定，腸管內(nèi)注入脫氣水（水域溫度37℃），使用顯微鏡（Olympus IX71倒置熒光顯微鏡——日本Olmpus公司）觀察治療前血管形態(tài)，記錄并將中心區(qū)域觀察血管做標記；然后將固定腸管放入注滿脫氣水的容器中。抽取脂氟顯微泡懸液0.2ml/kg，加

10、入生理鹽水稀釋至4ml，5min內(nèi)經(jīng)靜脈通道緩慢勻速注入。實驗組同時用超聲治療儀輻照之前觀察并標記的腸壁及腸系膜血管區(qū)域5 min，空白組假照目標腸壁及腸系膜5min。治療結(jié)束后，使用顯微鏡再次觀察標記血管，并記錄。然后經(jīng)耳緣靜脈注入伊文思藍溶液（2%）5ml，觀察伊文思藍在目標血管內(nèi)的灌注情況，并記錄。
　　血管分級：腸壁血管肉眼下可見，由于治療后，腸壁透光變差，且部分血管變形，內(nèi)徑測量不準確，所以在治療前使用顯微鏡放大40倍觀

11、察血管，可以明確觀察到腸系膜血管進入腸壁后每一級血管，并將血管分級。第一級：內(nèi)徑>100μm的血管，這級血管包含腸系膜血管，以及部分腸壁血管；第二級內(nèi)徑60-100μm的血管；第三級30-60μm；第四級10-30μm，這級血管為微小動、靜脈血管；第五級為<10μm的毛細血管網(wǎng)。在治療后再次用顯微鏡觀察治療區(qū)域，并統(tǒng)計出不同級別的動靜脈血管的損傷程度的不同。由于在顯微鏡視野下毛細血管呈網(wǎng)狀分布，難以計數(shù)，未計入統(tǒng)計學分析，故僅觀察超聲作

12、用下毛細血管的形態(tài)學改變。
　　損傷程度分級：損傷照程度由低到高分為四級，第一級血管周圍未見滲出，即在治療后血管未觀察到明顯的變化以及滲出；第二級血管周圍可見少量滲出，未形成血腫，在伊文思藍灌注后血管邊界模糊；第三級為血管周圍可見大量滲出并形成血腫；第四級是血管血流阻斷，即在靜脈注入伊文思藍后血管血流阻斷，遠端血管未見伊文思藍灌注，或者毛細血管可見紅藍分界。
　　病理學檢查：實驗結(jié)束后，使用戊巴比妥鈉(2.5%)10ml/k

13、g靜脈推注進行過量麻醉安樂死，立即切取治療中心的腸壁組織，置于10%福爾馬林溶液固定1d，經(jīng)脫水、石蠟包埋及蘇木素伊蘭（HE）染色等程序后，連續(xù)切片制成病理切面，顯微鏡下進行病理學觀察。
　　統(tǒng)計學方法：實驗組共18只兔，每只兔均對治療區(qū)域內(nèi)的一至四級血管進行統(tǒng)計分析，第五級血管（毛細血管）因計數(shù)困難而僅對損傷程度進行描述。一、二級廣州醫(yī)科大學碩士學位論文
　　血管均記錄3條動脈和3條靜脈血管，根據(jù)血管內(nèi)徑的不同，1-2級血

14、管每級動、靜脈血管數(shù)量各54條。第三級血管（30-60微米）在視野下可觀察到清晰的分叉，動靜脈血管各62支，第四級血管在視野下由第三級血管主干分叉出，血管清晰，長度大于100微米，符合第四級血管（10-30微米）要求的血管計數(shù)為96支動脈及102支靜脈。各組別之間損傷程度的比較采用卡方檢驗，以P<0.05有統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計分析采用SPSS13.0軟件。
　　結(jié)果：
　　統(tǒng)計學結(jié)果:
　　不同組動/靜脈血管兩兩比較：

15、r>　　01組>100μm VS60-100μm、02組>100μm VS30-60μm、03組>100μm VS10-30μm、04組60-100μm VS30-60μm、05組60-100μm VS10-30μm、06組30-60μm VS10-30μm
　　以上6組所得P值均小于0.05，說明兩兩之間在血管損傷中的頻數(shù)分布不同。第1-4級血管類型中：阻斷的發(fā)生率最高的是第四級（10-30μm）動/靜脈血管。大量滲出的發(fā)生率最

16、高的是第三級（30-60μm）動/靜脈血管；少量滲出的發(fā)生率最高的是第二級（60-100μm）動/靜脈血管；未見明顯損傷的發(fā)生率最高的是第一級（>100μm）的動/靜脈血管。
　　第五級血管毛細血管，在顯微鏡下放大100倍下觀察，取毛細血管顯示清晰且較均勻分布而少大血管的區(qū)域，一個視野內(nèi)的毛細血管分布區(qū)域分為36×48個小格，觀察其中滲出所占格數(shù)，得到毛細血管滲出面積為（4.3±1.7）%。在顯微鏡下放大200倍觀察毛細血管管壁較

17、薄，可觀察到部分毛細血管內(nèi)紅細胞的流動，在注入伊文思藍后，多個被阻斷的毛細血管出現(xiàn)明顯的紅藍交界。
　　血管形態(tài)改變：治療后可見血管發(fā)生明顯的變形。有的血管內(nèi)徑發(fā)生變化，部分動脈血管內(nèi)徑比治療前增寬；部分動脈血管管壁呈波浪狀改變；有的血管走行較治療前有改變，表現(xiàn)為血管分叉處夾角增大，多出現(xiàn)在第二、三、四級血管。
　　在病理切片中，空白組各級血管管壁平整，血管周圍未見紅細胞滲出，部分血管內(nèi)可見少量紅細胞堆積，腸壁組織結(jié)構(gòu)規(guī)則，

18、內(nèi)未見紅細胞溢出。治療組微動靜脈血管對比空白組可見明顯擴張，以靜脈血管為主，擴張血管內(nèi)可見大量紅細胞堆積，以血管分叉處為主；部分微動靜脈血管內(nèi)可見不典型性血栓，呈長條狀，貫通血管；部分血管周圍可見紅細胞溢出，血管壁內(nèi)皮細胞可見少量脫落。周圍組織腸黏膜、腸黏膜下以及肌層內(nèi)紅細胞堆積較明顯，腺體間隙偶可見微小動靜脈末端以及毛細血管。
　　結(jié)論：
　　1、超聲聯(lián)合微泡可以對腸系膜及腸壁各類型血管產(chǎn)生不同的損傷作用。
　　2、