去整合素Echistatin RGD模體定點突變對其功能的影響及相應(yīng)蛋白質(zhì)基因工程新藥研究.pdf

1、去整合素(disintegrin)是一類來源于蛇毒蛋白的小分子量蛋白質(zhì)，這類蛋白質(zhì)在氨基酸序列上有高度的相似性，它們均由49～84個氨基酸組成，序列中含有8～14個半胱氨酸(cystine)，形成4～7對二硫健，都含有一個RGD(Arg-Gly-Asp)環(huán)(loop)，這些蛋白質(zhì)利用其RGD序列和整合素(integrin)結(jié)合，因而競爭性的抑制整合素和相應(yīng)配體的結(jié)合，使得整合素的功能被抑制?；谌フ纤乜梢耘c相關(guān)整合素(αⅡbβ3、αv

2、β3、α5β1等)發(fā)生特異結(jié)合，從而阻斷由整合素介導的多種生理病理反應(yīng)，近年來已經(jīng)成為醫(yī)學研究的熱點，特別是在抑制血栓形成、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、抑制新生血管的生成、防治骨質(zhì)疏松等領(lǐng)域。越來越多的人們開始致力于去整合素藥物的研究與開發(fā)。如何選擇合適的去整合素作為研究對象，開發(fā)新一代抗栓、抗癌藥物是許多研究機構(gòu)多年來一直努力和奮斗的目標，作為分子量較小的Echistatin以其活性高、免疫原性小成為主要研究對象。 但是，由于去整合素主要

3、是通過其RGD序列識別αⅡbβ3、αvβ3等多種整合素從而發(fā)揮作用。而αⅡbβ3主要存在于活化的血小板上，αvβ3主要表達于新生血管內(nèi)皮細胞和破骨細胞上，在多種腫瘤細胞上也有表達，因此去整合素介導的生物效應(yīng)作用廣泛但不特異。盡管去整合素獨特的結(jié)構(gòu)特征理論上可以治療多種相關(guān)疾病，但從臨床治療考慮，我們?nèi)匀幌Ｍ軌虻玫叫再|(zhì)特異，作用專一的去整合素藥物。目前已有研究發(fā)現(xiàn)去整合素中RGD周圍序列的不同會影響其作用的選擇性，但具體機制并不清楚。近

4、年來發(fā)現(xiàn)含有KGD(Lys-Gly-Asp)的去整合素更傾向于結(jié)合整合素αⅡbβ3，選擇性抑制αⅡbβ3的功能，但對αvβ3，α5β1結(jié)合能力較弱；另外，在研究不同去整合素的結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)，當RGD環(huán)較寬時，對αIIbβ3的結(jié)合能力增強，這些發(fā)現(xiàn)為去整合素結(jié)構(gòu)和功能研究提供了新的思路。 實驗室自上世紀90年代中期開始研究Echistatin，并取得了一定突破，隨著對多種去整合素研究的不斷深入，本世紀初，我們將研究重點放在去整合素結(jié)

5、構(gòu)與功能的研究上，課題組根據(jù)不同去整合素中RGD/KGD與目的肽段的結(jié)合特征，適當改變EchistatinRGD周圍的部分氨基酸序列，研究其突變體與相應(yīng)整合素結(jié)合及功能的變化，并根據(jù)其功能開發(fā)相應(yīng)基因工程藥物，這項研究若能順利實施，無疑會填補我國在該領(lǐng)域研究的空白，即使與國外同類藥物相比，也將會具有多種技術(shù)優(yōu)勢。首先我們根據(jù)Barbourin含有KGD的結(jié)構(gòu)提出對Echistatin中的RGD進行突變，使其變?yōu)镵GD；繼而根據(jù)RGD環(huán)變

6、寬時結(jié)合αⅡbβ3能力增強的特點將第27位氨基酸突變?yōu)閃，突變后的RGD模體及周邊序列變?yōu)锳KGDWM，然后利用基因工程技術(shù)對Echistatin(AKGDWM)進行制備，探索該突變體的生物學功能，開發(fā)活性更高，作用更特異的抗血栓藥物;其次，根據(jù)rhodostomin突變體特異結(jié)合αvβ3的特點，將EchistatinRGD模體及周邊序列突變?yōu)锳RGDNM，探索該突變體的生物學功能，開發(fā)作用更加特異的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物。 1.Ec

7、histatin(AKGDWM)基因工程新藥上游工藝標準化體系研究本部分主要探索Echistatin(AKGDWM)原核表達體系的構(gòu)建，包括Echistatin(AKGDWM)單獨表達體系和融合蛋白表達體系構(gòu)建，并優(yōu)化表達條件，通過比較，建立并確定Echistatin(AKGDWM)上游制備工藝的標準化體系，為下游工藝奠定基礎(chǔ)。 2.Echistatin(AKGDWM)基因工程新藥下游工藝標準化體系研究主要探索Echistat

8、in(AKGDWM)突變體下游制備工藝的標準化研究，包括工程菌高密度發(fā)酵工藝的探索和優(yōu)化，目的蛋白分離純化工藝研究與優(yōu)化，并最終建立Echistatin(AKGDWM)下游工藝標準化體系。 3.Echistatin(AKGDWM)基因工程新藥藥效學研究主要對課題組制備的Echistatin(AKGDWM)突變體進行藥效學研究，包括：體外抗血小板聚集活性的檢測，血小板聚集量效和時效關(guān)系研究，血栓形成抑制實驗及CAM新生血管抑制實

9、驗研究，以期探討其蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。 在Echistatin(AKGDWM)對ADP活化的體外血小板聚集抑制實驗中，得出血小板聚集的IC50約為60.42nM，低于天然Echistatin抑制血小板聚集的IC50(130nM)。 在血小板聚集量效關(guān)系研究中，Echistatin突變前后抑制聚集活性均呈劑量依賴關(guān)系，在相同劑量下，突變體Echistatin(AKGDWM)抑制血小板聚集活性高于天然Echistati

10、n；在抑制血小板聚集時效關(guān)系研究中，給藥40min，Echistatin抑制作用已經(jīng)下降，而突變后的Echistatin(AKGDWM)在160min時尚有60％的活性。在抑制血栓形成實驗中也得到了相同的結(jié)論。 4.Echistatin(ARGDNM)基因工程上游工藝標準化體系研究課題組根據(jù)rhodostomin突變體特異結(jié)合αvβ3的特點，通過定點突變EchistatinRGD模體周邊序列，使其突變?yōu)锳RGDNM，根據(jù)已經(jīng)建

11、立的Echistatin(AKGDWM)突變體生產(chǎn)工藝(見第一篇內(nèi)容)，建立Echistatin(ARGDNM)突變體基因工程新藥上游生產(chǎn)工藝標準化體系。 5.Echistatin(ARGDNM)基因工程下游工藝標準化體系研究課題組建立的Echistatin(AKGDWM)工程菌發(fā)酵工藝、融合蛋白分離純化工藝是經(jīng)過大量實驗摸索，優(yōu)化多種條件的基礎(chǔ)上建立并加以完善形成的。我們應(yīng)用已經(jīng)建立的高密度發(fā)酵工藝和分離純化工藝(參見前述E

12、chistatin(AKGDWM)基因工程新藥下游工藝標準化體系研究)，對Echistatin(ARGDNM)突變體工程菌進行高密度發(fā)酵，并應(yīng)用DEAE陰離子交換層析分離純化融合蛋白，獲得了較高的細菌得率(112g/L)和較高的蛋白產(chǎn)量(每克濕菌獲突變體蛋白約19.23mg)。因此Echistatin(ARGDNM)突變體下游工藝的研究完全可以參照Echistatin(AKGDWM)突變體的下游工藝，這不僅說明了先前建立的基因工程上下游

13、工藝的穩(wěn)定性和可靠性，而且利用一套成熟的基因工程制備體系制備生產(chǎn)兩種(包括Echistatin有三種)蛋白，體現(xiàn)了經(jīng)濟節(jié)約的原則，這既符合大規(guī)模生產(chǎn)新藥的技術(shù)要求，也最大限度的降低了生產(chǎn)成本。為類似多肽類藥物的研究與開發(fā)提供了思路和方法。 6.Echistatin(ARGDNM)基因工程新藥藥效學研究主要對課題組制備的Echistatin(ARGDWM)突變體進行藥效學研究，其內(nèi)容與前面設(shè)計的藥效內(nèi)容一致。經(jīng)過比較，Echis

14、tatin(ARGDWM)突變體抑制血小板聚集的IC50為226.03nM，抑制CAM血管新生的IC50為8.69nM，這一研究結(jié)果證實了突變后的Echistatin(ARGDWM)更傾向于結(jié)合αvβ3，識別并結(jié)合αIIbβ3的能力下降，這為后續(xù)臨床前研究奠定了基礎(chǔ)，對于研究與開發(fā)作用更加特異、療效更加確切的去整合素藥物具有重要的指導意義。 7.Echistatin(AKGDWM)突變體多順反子原核串聯(lián)表達體系構(gòu)建本部分根據(jù)原

15、核生物mRNA多順反子的特點，以Echistatin(AKGDWM)DNA序列為例，通過在目的基因5’端設(shè)計SD間隔序列和起始密碼ATG，在目的基因3端設(shè)計終止密碼TAA(或TAG)。在每一順反子前設(shè)計合適酶切位點使目的基因以三拷貝串聯(lián)方式排列，每一拷貝都有獨立的起始密碼和終止密碼，拷貝之間有設(shè)計的SD間隔序列，探索通過設(shè)計SD間隔序列，利用串聯(lián)方式對小分子多肽進行高效表達，以期解決小分子多肽難以單獨高效表達的問題，為開發(fā)利用小分子多肽