TGF-β-Smad信號(hào)通路相關(guān)細(xì)胞因子在小鼠非酒精性脂肪肝干預(yù)中的差異表達(dá).pdf

1、研究目的:
　　探討有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和中藥干預(yù)對(duì)高脂膳食誘導(dǎo)下小鼠非酒精性脂肪肝形成的抑制作用，初步揭示有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和中藥對(duì)改善小鼠非酒精性肝臟損傷的機(jī)制，并探討相關(guān)細(xì)胞因子的關(guān)聯(lián)作用。
　　研究方法:
　　實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組:KM種雄性小鼠80只，體重18～22g，室溫23℃到25℃自然光照飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)小鼠購(gòu)入后，通過高糖高脂膳食灌胃建立小鼠非酒精性脂肪肝模型。每天固定時(shí)間進(jìn)行灌胃，每日1次（下午13時(shí)），每周6次。通過5周灌

2、胃構(gòu)建小鼠非酒精性肝損傷模型。建模結(jié)束后隨機(jī)選取模型小鼠5只，取新鮮肝組織進(jìn)行HE染色，檢驗(yàn)細(xì)胞中脂滴著色情況。從造模成功所有小鼠中，淘汰傷病小鼠，保留60只。隨機(jī)分成5組，每組12只，各組分別為:陰性對(duì)照組(OJ)、陽性對(duì)照組(Y)、中藥組(M)、有氧運(yùn)動(dòng)組(E)、中藥聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)組(E+M）。實(shí)驗(yàn)方案:有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)采用水平動(dòng)物跑臺(tái)方式，前3天為適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練，每次30min，速度8m/min。第4-6天運(yùn)動(dòng)時(shí)間逐漸遞增至60min，

3、速度12m/min(Pm15:00-17:00)，維持此運(yùn)動(dòng)量持續(xù)訓(xùn)練7周，每周訓(xùn)練6次，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練時(shí)驅(qū)趕停止不動(dòng)的小鼠已達(dá)到額定訓(xùn)練負(fù)荷。中藥干預(yù)的最佳有效劑量通過按人和小鼠的體表面積折算得出等效劑量，并通過口灌胃進(jìn)行干預(yù)，灌胃前配備成0.5ml灌胃（藥劑濃度為0.2Λg/g）。中藥聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組劑量:按200ml/kg體重在實(shí)驗(yàn)前配備成所需要濃度進(jìn)行灌服給藥（總體積0.5ml）。陰性對(duì)照組、跑臺(tái)組采用相同時(shí)間灌服同體積生理鹽水進(jìn)行干預(yù)，陽

4、性對(duì)照組主要使用水飛薊賓懸浮液進(jìn)行灌服，每次灌胃劑量按人與小鼠體表面積折算0.5ml/次（相當(dāng)于人體用藥的20倍）。所有需要進(jìn)行灌胃干預(yù)的小鼠均灌服7周，每周6次。實(shí)驗(yàn)期間記錄小鼠的行為學(xué)變化。7周干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠禁食過夜，隨后將肝組織從體內(nèi)剝離進(jìn)行取材，對(duì)各個(gè)干預(yù)組的小鼠肝臟組織情況采用顯微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)觀察，評(píng)價(jià)各個(gè)干預(yù)小組的小鼠肝組織損傷情況;通過免疫組化檢測(cè)法來評(píng)定小鼠肝組織TGF-β1生長(zhǎng)因子的蛋白表達(dá)水平情況;RT-PCR法

5、檢測(cè)肝組織中smad3、smad4 mRNA表達(dá)程度;血生化檢測(cè)分析血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、以及總膽固醇(TC)、和超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)在血清中的含量水平。
　　研究結(jié)果:
　　①HE染色顯示:陰性對(duì)照組脂肪病變程度最為明顯，小鼠肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量纖維化增生，肝細(xì)胞發(fā)生變性情況嚴(yán)重，有大面積細(xì)胞病變壞死出現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)變形排列混亂;有氧運(yùn)動(dòng)組與陰性對(duì)照組肝脂肪

6、病變程度進(jìn)行比較評(píng)分有降低;任可見少量肝細(xì)胞纖維化，肝細(xì)胞變性情況;中藥干預(yù)組和運(yùn)動(dòng)干預(yù)組與陰性對(duì)照組相比，肝組織細(xì)胞任然有較少病變細(xì)胞分布出現(xiàn)，肝小葉組織結(jié)構(gòu)有所改變，但肝細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)欠整齊;陽性干預(yù)組和中藥聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)組較陰性組對(duì)比，肝組織無明顯壞死情況，肝小葉組織結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞排列較整齊。
　　②血清學(xué)結(jié)果:通過單因素方差分析法，將有氧運(yùn)動(dòng)組、中藥組、陽性對(duì)照組和有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合中藥組與陰性對(duì)照組分別進(jìn)行兩兩比較，可知在不

7、同的干預(yù)方式下小鼠血清中 ALT、AST和TG、TC、SOD、MDA水平較陰性組都有不同程度降低(P＜0.05)。與陰性組對(duì)比有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合中藥組能明顯降低高脂飲食小鼠肝臟中丙二醛(MDA)的含量的趨勢(shì)，(p＜0.01)，從而使肝臟MDA含量進(jìn)一步降低。與陰性組相比有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練聯(lián)合中藥組，有顯著提高高脂膳食大鼠肝臟氧化物歧化酶(SOD)的活性作用(p＜0.01)。中藥聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)組與陰性對(duì)照組相比ALT、AST和TG、TC檢測(cè)指標(biāo)有明顯下

8、降趨勢(shì)(P＜0.05)說明兩者間有協(xié)同作用，ALT，AST、TG、TC的活性表達(dá)程度是進(jìn)一步降低了。
　　③免疫組化檢測(cè)顯示:各干預(yù)小組中TGF-β1生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)水平均低于陰性對(duì)照組，其中以中藥聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)組蛋白表達(dá)水平差異最大(P＜0.01)。
　　④RT-PCR結(jié)果顯示:通過檢測(cè)，小鼠肝組織中smad3、smad4 mRNA表達(dá)水平由高到低排名依次為:陰性對(duì)照組、有氧運(yùn)動(dòng)組、陽性組、中藥組以及中藥聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)組。其中