細(xì)菌GIsul2基因島的轉(zhuǎn)移與調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、基因水平轉(zhuǎn)移(Horizontal gene transfer,HGT)可導(dǎo)致細(xì)菌不同種屬間個(gè)體DNA的交換，從而使細(xì)菌對環(huán)境的適應(yīng)性增強(qiáng)，是細(xì)菌進(jìn)化的重要途徑之一。基因島(Genomic Islands，GEIs)是基因水平轉(zhuǎn)移的重要載體?？梢苿拥幕驆u能夠整合到宿主的染色體上，并在特定的條件下切除，進(jìn)而通過轉(zhuǎn)化、接合或轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式轉(zhuǎn)移到新的宿主中，是非常活躍的移動元件。基因島具有多種生物學(xué)功能，如抗生素抗性、致病性、異源物質(zhì)降解及重金

2、屬抗性等?；驆u的轉(zhuǎn)移不僅有助于微生物對外界環(huán)境的適應(yīng)，而且能夠造成可變基因在不同種屬細(xì)菌間的廣泛傳播，如基因島攜帶的毒力和耐藥基因的傳播導(dǎo)致了致病性的多重耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生，嚴(yán)重威脅人類健康。
　　本研究中所涉及的GIsul2基因島在陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae subspecies)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)和志賀桿菌（Shigella flexneri）中都有發(fā)現(xiàn)報(bào)道

3、。其中GIsul2基因島不僅攜帶了多重耐藥基因和砷抗性基因而且在GIsul2基因島的尾端存在一個(gè)ISCR2移動元件。已有研究表明，ISCR家族移動元件與耐藥基因的傳播是存在聯(lián)系的，但其轉(zhuǎn)移調(diào)控機(jī)制仍未闡明，亟待研究。本文對細(xì)菌中GIsul2基因島的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、轉(zhuǎn)移和調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了深入的研究，揭示了GIsul2基因島的轉(zhuǎn)移和初步的調(diào)控分子機(jī)制，為遏制基因島的傳播提供重要策略。
　　研究目的:
　　本文以GIsul2基因島為研究對

4、象，利用雙質(zhì)粒系統(tǒng)研究該基因島在移動過程中可能存在的轉(zhuǎn)移及調(diào)控機(jī)制，探究GIsul2基因島對細(xì)菌耐藥基因傳播的影響。通過對GIsul2基因島轉(zhuǎn)移調(diào)控因子功能的進(jìn)一步研究，進(jìn)而找到抑制基因島的轉(zhuǎn)移的手段。從細(xì)菌水平基因轉(zhuǎn)移和基因調(diào)控的角度深入研究病原菌致病性、耐藥性和傳播性的進(jìn)化機(jī)制，為解決細(xì)菌耐藥性問題提供新的理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.以實(shí)驗(yàn)室測序的Shigella flexneri51575為研究對象，通過分子克

5、隆手段獲得大小為15kb的GIsul2基因島。
　　2.構(gòu)建溫敏供體質(zhì)粒pKD46-GIsul2以及相關(guān)基因敲除型供體質(zhì)粒，同時(shí)構(gòu)建相關(guān)受體pKF18-GMP800。
　　3.將供受體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌感受態(tài)DH5α(recA-)，構(gòu)建雙質(zhì)粒系統(tǒng)檢測GIsul2基因島轉(zhuǎn)移情況。
　　4.將GIsul2基因島中關(guān)鍵基因通過分子克隆手段構(gòu)建最小轉(zhuǎn)移單元，在雙質(zhì)粒系統(tǒng)中，研究相關(guān)因子的相互作用。
　　5.將引起GIsu

6、l2基因島轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵蛋白P4-like整合酶通過PCR的方式克隆到原核蛋白表達(dá)載體pET28a載體上，將構(gòu)建成功的克隆轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21(DE3)感受態(tài)中，使用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化P4-like整合酶。設(shè)計(jì)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證P4-like整合酶的功能。
　　研究結(jié)果:
　　1.通過PCR、酶切和測序等手段檢測到GIsul2基因島的轉(zhuǎn)移，并且GIsul2基因島在轉(zhuǎn)移的同時(shí)能夠介導(dǎo)ISCR2單元的轉(zhuǎn)移。
　　2.基因敲除實(shí)驗(yàn)

7、結(jié)果表明，P4-like整合酶及基因島邊界的正向重復(fù)序列(direct repeats，DRs)對GIsul2基因島以及ISCR2單元的轉(zhuǎn)移是必須的。
　　3.GIsul2基因島在轉(zhuǎn)移過程中存在fitA、alpa等輔助因子，這些輔助因子能夠調(diào)控GIsul2基因島及ISCR2單元轉(zhuǎn)移頻率和轉(zhuǎn)移形式。
　　4.將P4-like整合酶與DR區(qū)序列通過PCR手段構(gòu)建最小移動單元，通過雙質(zhì)粒系統(tǒng)的檢測，發(fā)現(xiàn)P4-like整合酶與DR區(qū)

8、能夠介導(dǎo)最小單元的轉(zhuǎn)移。
　　5.在最小單元的與相應(yīng)的受體構(gòu)建的雙質(zhì)粒系統(tǒng)中，研究發(fā)現(xiàn)在基因島的邊界處存在大約100bp的輔助因子結(jié)合序列。
　　6.利用純化的P4-like整合酶進(jìn)行體外酶切實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，P4-like整合酶具有兼性拓?fù)洚悩?gòu)酶的功能，并能夠特異性的結(jié)合到DR序列上。
　　研究結(jié)論:
　　1.GIsul2基因島在轉(zhuǎn)移的同時(shí)能夠介導(dǎo)ISCR2單元的轉(zhuǎn)移。在轉(zhuǎn)移的過程中，除了P4-like整合酶和DR序列