BMSCs和Non-BMSCs源細(xì)胞移植后機(jī)體免疫反應(yīng)差異的比較.pdf

1、近年來，應(yīng)用組織工程技術(shù)體外分離和培養(yǎng)所需細(xì)胞，通過細(xì)胞移植植入體內(nèi)，為體內(nèi)相關(guān)疾病的細(xì)胞替代治療提供了新的途徑，引起了學(xué)術(shù)界的探討熱潮。但由于多種組織細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)難度極大，限制了這一技術(shù)的開展。BMSCs分離培養(yǎng)較為容易，可以分化為多種組織細(xì)胞。我們的前期工作已成功實現(xiàn)了大鼠BMSCs向肝細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，并經(jīng)動物實驗表明具有一定的肝功能代償能力，可以作為肝細(xì)胞移植的細(xì)胞源。BMSCs的低免疫原性在體外己得到證實，但體內(nèi)的免疫學(xué)特

2、征還存爭議，因此，進(jìn)一步探明BMSCs是否在體內(nèi)具有相對于Non-BMSCs源細(xì)胞的低免疫原性，對于BMSCs細(xì)胞移植能否在臨床得到廣泛的應(yīng)用就顯得十分必要。盡管已有研究表明BMSCs具有低免疫原性，但實際應(yīng)用中通常先將BMSCs定向誘導(dǎo)分化為特定成熟細(xì)胞，然后再行細(xì)胞移植。BMSCs的低免疫原性是否會隨著分化狀態(tài)的改變而發(fā)生改變?探明這一問題對于細(xì)胞移植技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用無疑具有十分重要的意義。 基于目前的研究現(xiàn)狀以及本研究組前

3、期的工作結(jié)果，本實驗擬采用BMSCs與Non-BMSCs源細(xì)胞進(jìn)行同種異體與異種移植，通過對受體動物的血象分析和細(xì)胞移植位點的形態(tài)學(xué)觀察，評價不同細(xì)胞移植后的免疫應(yīng)答差異，確認(rèn)BMSCs是否在體內(nèi)仍具有相對于Non—BMSCs來源細(xì)胞的低免疫原性。同時也對BMSCs分化前后免疫原性的變化特征進(jìn)行比較分析。 材料與方法： 1.細(xì)胞的準(zhǔn)備從SD雄性大鼠的雙側(cè)股骨和脛骨中用DMEM/F-12沖洗骨髓細(xì)胞，采用貼壁法分離出骨髓間

4、質(zhì)細(xì)胞。采用換半液和一傳二的傳代培養(yǎng)方法，傳至第5代；構(gòu)建2-AAF/CCL4急性肝損傷動物模型，獲取動物肝臟，提取肝組織萃取物。以肝組織萃取物作為刺激物對骨髓問質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化實驗，根據(jù)BMSCs誘導(dǎo)前后的形態(tài)學(xué)特征以及分子表達(dá)譜特征確定分化狀態(tài)。由中山大學(xué)動物中心提供大鼠肝細(xì)胞株(BRL)，復(fù)蘇，傳代培養(yǎng)。 2.動物的準(zhǔn)備由中山大學(xué)動物中心提供SD大鼠；由中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供新西蘭大白兔。 3.

5、細(xì)胞移植 將大鼠BMSCs與大鼠BRL經(jīng)股靜脈與皮下注射移植到大鼠體內(nèi)；將大鼠BMSCs，分化狀態(tài)BMSCs與大鼠：BRL經(jīng)耳沿靜脈與皮下注射移植到新西蘭大白兔體內(nèi)。 4.收集不同時間段動物的外周血，皮膚，脾臟，胸腺通過比較不同時間段動物的外周血免疫細(xì)胞數(shù)目，皮膚、脾臟、胸腺病理形態(tài)變化，分析BMSCs與Non—BMSCs源細(xì)胞移植后機(jī)體免疫反應(yīng)的差異。 實驗結(jié)果： 1.在同種異體移植中，移植BMSCs和

6、BRL細(xì)胞后動物淋巴細(xì)胞數(shù)目逐漸升高，在24h，72h，168h，移植BMSCs組比移植BRL組淋巴細(xì)胞數(shù)目少、淋巴細(xì)胞百分率小。在同種異體移植中， BMSCs與BRL細(xì)胞在移植后單核細(xì)胞數(shù)目及百分率先是稍有升高后一直下降直至低于移植前，但除在168h移植BMSCs組比移植BRZ，組單核細(xì)胞數(shù)目少，在各時段移植BMSCs組比移植BRL組單核細(xì)胞數(shù)目多，單核細(xì)胞百分率大。 2.在同種異體移植中，在24h注射到動物皮下的BMSCs細(xì)

7、胞在24h無明顯壞死，但BRL細(xì)胞大片壞死凋亡；在72h，168 h，注射到動物皮下的BMSCs細(xì)胞周圍雖然毛細(xì)血管擴(kuò)張，但無明顯壞死，無明顯炎細(xì)胞浸潤，但BRL細(xì)胞團(tuán)內(nèi)及周圍大量單核細(xì)胞浸潤，細(xì)胞團(tuán)內(nèi)遺留壞死空隙；對照組在各時段無明顯病理變化。 3.同種異體移植在24h，72h，168h，動物的胸腺在光鏡下的形態(tài)無明顯變化。 4.同種異體移植在24h，72h，168h，動物的脾臟在光鏡下的形態(tài)無明顯變化。 5.

8、在異種移植中，移植BMSCs和BRL細(xì)胞后動物淋巴細(xì)胞數(shù)目逐漸升高，在120h最高，在168h稍有下降，但仍高于移植前，移植BMSCs組淋巴細(xì)胞比移植BRL組少；移植BMSCs組淋巴細(xì)胞百分比率逐漸降低，移植BRL組淋巴百分比率無太大變化，移植BMSCs組淋巴細(xì)胞百分率比BRL組??；動物單核細(xì)胞數(shù)目及百分比率在24h稍有下降后逐漸升高，移植BMSCs組單核細(xì)胞數(shù)目及百分率比移植BRL組高。 6.在異種移植中，在168h注射到動物

9、皮下的BMSCs細(xì)胞無明顯壞死，BRL細(xì)胞團(tuán)內(nèi)出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤，碎片狀核。 7.異種移植動物的胸腺在168h光鏡下的形態(tài)無明顯變化。 8.異種移植動物的脾臟在168h光鏡下的形態(tài)無明顯變化。 9.在異種移植中，移植分化狀態(tài)BMSCs組的淋巴細(xì)胞數(shù)目、單核細(xì)胞數(shù)目和單核細(xì)胞百分率不高于移植未分化BMSCs組。在168h，移植到到動物皮下的未分化的BMSCs細(xì)胞無明顯壞死，但移植到皮下的分化狀態(tài)BMSCs有不同程度的單

10、核巨噬細(xì)胞浸潤，細(xì)胞核碎片分化狀態(tài)BMSCs有不同程度的單核巨噬細(xì)胞浸潤，細(xì)胞核碎片。異種移植動物的胸腺、脾臟在光鏡下的形態(tài)無明顯變化。 結(jié)論： 1.動物血象的變化是機(jī)體免疫應(yīng)答最明顯的指標(biāo)。本實驗分別使用BMSCs和BRL細(xì)胞進(jìn)行同種異體移植后發(fā)現(xiàn)，BMSCs移植條件下受體動物的淋巴細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞百分率都低于使用BRL細(xì)胞移植的動物。這種差異在細(xì)胞異種移植條件下尤為明顯。表明BMSCs作為細(xì)胞移植的細(xì)胞源時，確實具有

11、低免疫原性的優(yōu)勢。 2.BMSCs定向誘導(dǎo)分化后所引起的動物淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)目增加幅度均未超出定向誘導(dǎo)前的水平，表明BMSCs的低免疫原性并未隨BMSCs分化狀態(tài)的改變而發(fā)生明顯改變。 3.移植部位皮膚的病理形態(tài)改變可以比較直觀地反映機(jī)體對移植細(xì)胞的局部免疫反應(yīng)。本實驗分別使用BMSCs和BRL細(xì)胞進(jìn)行同種異體和異種移植后發(fā)現(xiàn)，移植至皮下的BMSCs無明顯壞死及炎性細(xì)胞浸潤，但移植至皮下的BRL則出現(xiàn)大面積壞死和炎細(xì)

12、胞浸潤，進(jìn)一步佐證了BMSCs的低免疫原性。 4.細(xì)胞移植后受體動物的脾臟和胸腺未能出現(xiàn)明顯的病理形態(tài)改變，可能與觀察時間不足有關(guān)。 5.僅依靠對外周血免疫細(xì)胞的簡單計數(shù)，觀察移植部位皮膚以及動物脾臟、胸腺的病理形態(tài)學(xué)變化，還不能全面反映機(jī)體免疫應(yīng)答狀況，觀察指標(biāo)有待進(jìn)一步豐富。 6.總體而言，BMSCs作為細(xì)胞移植的細(xì)胞源時確實具有相對于Non-BMSCs源細(xì)胞的低免疫原性優(yōu)勢，并且這種優(yōu)勢并不隨BMSCs分化