單分子力測(cè)定技術(shù)用于活細(xì)胞膜蛋白表達(dá)與分布的研究.pdf

1、膜蛋白在細(xì)胞表面識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶活性和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)确矫姘缪葜匾慕巧?因此在活細(xì)胞水平研究膜蛋白的表達(dá)與分布情況具有重要意義?；谠恿︼@微鏡(AFM)的單分子力測(cè)定(SMFM)技術(shù)特別適合在近生理環(huán)境下測(cè)定生物分子間的相互作用,本文利用這一技術(shù)研究了膜蛋白分子與抗體或者核酸適體的相互作用,并從納米尺度上考察了膜蛋白分子在活細(xì)胞表面的分布情況,有利于進(jìn)一步了解活細(xì)胞水平上膜蛋白分子的性質(zhì),對(duì)研究膜蛋白介導(dǎo)的生物過(guò)程具有重要的參考價(jià)值。

2、本研究主要內(nèi)容包括：
　　 ⑴基于SMFM技術(shù)在活細(xì)胞水平上研究了細(xì)胞膜上多藥耐藥相關(guān)蛋白1(MRP1)的表達(dá)情況。通過(guò)測(cè)定MRP1與其抗體間的相互作用力,考察了人舌癌細(xì)胞經(jīng)高劑量平陽(yáng)霉素(BLM)反復(fù)間歇誘導(dǎo)前后細(xì)胞表面MRP1的表達(dá)差異。結(jié)果表明,MRP1與其抗體間存在特異性相互作用力,當(dāng)針尖運(yùn)動(dòng)速率為2.5μm/s時(shí),其大小約為182±35pN。同時(shí),藥物誘導(dǎo)后MRP1在人舌癌細(xì)胞上的表達(dá)明顯增強(qiáng)。研究結(jié)果對(duì)于了解活細(xì)胞水

3、平上MRP1的表達(dá)提供了新的方法,有助于癌細(xì)胞多藥耐藥性(MDR)的研究,還有望用于活細(xì)胞水平上其他生物分子的表征。
　　 ⑵基于SMFM技術(shù)和激光共聚焦熒光顯微技術(shù)聯(lián)用,研究了乳腺癌細(xì)胞膜上肌腱蛋白C(Tenascin-C)的表達(dá)與分布情況。本工作利用SMFM技術(shù)測(cè)定了乳腺癌細(xì)胞膜上Tenascin-C與其核酸適體的相互作用,并通過(guò)AFM與激光共聚焦顯微鏡聯(lián)用考察了Tenascin-C在乳腺癌細(xì)胞表面的表達(dá)與分布情況。結(jié)果表明

4、,Tenascin-C與其核酸適體GBI-10存在特異性相互作用力,當(dāng)針尖運(yùn)動(dòng)速率為2μm/s時(shí),其大小約為190±15 pN;Tenascin-C在乳腺癌細(xì)胞表面表達(dá)較強(qiáng),在正常乳腺細(xì)胞上幾乎不表達(dá)。本工作拓展了SMFM技術(shù)在活細(xì)胞水平上核酸適體-蛋白質(zhì)相互作用研究中的應(yīng)用,有望為癌癥發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究提供有價(jià)值的信息。
　　 ⑶基于SMFM技術(shù)研究了肝癌細(xì)胞膜上Tenascin-C的表達(dá)與分布情況。由于Tenascin-C

5、在不同組織器官上表達(dá)不同,且其往往與癌癥的發(fā)生有關(guān),因此本工作在上一工作的基礎(chǔ)上比較了幾種不同肝癌細(xì)胞株上的Tenascin-C與其核酸適體的相互作用,并通過(guò)AFM與激光共聚焦顯微鏡聯(lián)用考察了Tenascin-C在幾種不同肝癌細(xì)胞株表面的表達(dá)與分布情況。結(jié)果表明,幾種不同肝癌細(xì)胞株上Tenascin-C與其核酸適體存在特異性相互作用力,當(dāng)針尖運(yùn)動(dòng)速率為2μm/s時(shí),其大小約為190±15 pN,與乳腺癌細(xì)胞上Tenascin-C與核酸適