桑白皮中對hCE2有抑制作用的成分研究.pdf

1、目的：桑白皮是臨床常用中草藥，具有瀉肺平喘、利水消腫的功效，目前多用于治療肺熱痰多引起的喘咳、實(shí)證水腫等疾病。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，桑白皮具有抗炎、抗腫瘤、止瀉等多種作用。伊立替康是臨床常用抗癌藥物，廣泛用于成人轉(zhuǎn)移性大腸癌的化療。伊立替康在人體經(jīng)羧酸酯酶2（hCE2）代謝后的產(chǎn)物SN-38可對腸道造成損傷而引起嚴(yán)重的遲發(fā)型腹瀉副作用，大大限制了伊立替康在臨床中的應(yīng)用。hCE2是人體內(nèi)重要的藥物代謝酶，在腸道中呈高分布。聯(lián)合應(yīng)用安全、高效

2、的hCE2抑制劑可減緩這一嚴(yán)重副作用，提高伊立替康化療患者的耐受性和生存質(zhì)量。本研究旨在鑒定桑白皮中含有的hCE2天然抑制劑，并對其抑制能力進(jìn)行表征，為桑白皮緩解伊立替康相關(guān)致死性腹瀉副作用提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：1.利用熒光酶標(biāo)儀構(gòu)建人肝微粒體（HLMs）中hCE2的探針底物（FD）及其相應(yīng)代謝產(chǎn)物的定量分析方法，采用體外人肝微粒體-羧酸酯酶探針底物共同孵育的方法，評估桑白皮提取液對 hCE2活性的影響。2.利用超高速液相色譜

3、（UFLC-UV）對桑白皮提取液所含有的化學(xué)成分進(jìn)行片段分離，每隔30s一個連續(xù)接取LC洗脫片段，并對接取的180個LC片段進(jìn)行抑制活性測定，從而建立桑白皮提取液對hCE2的指紋圖譜。參照標(biāo)準(zhǔn)品，利用液相色譜-二極管陣列檢測器-電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-DAD-ESI-MS/MS），通過對比LC保留時間、紫外光譜和高分辨質(zhì)譜鑒定桑白皮中對 hCE2有抑制活性的成分。3.采用體外人肝微粒體-羧酸酯酶探針底物共同孵育的方法評估每種活性成

4、分對 hCE2的抑制活性，利用Graphpad6.0非線性擬合計算其半數(shù)抑制濃度IC50值。繼續(xù)用Lineweaver-Burk作圖和 Dixon作圖計算抑制動力學(xué)參數(shù) Ki并判斷抑制類型。4.利用標(biāo)準(zhǔn)品做出桑白皮所含活性成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算桑白皮中各種活性成分的含量。
　　結(jié)果：1.桑白皮乙醇提取物對伊立替康的關(guān)鍵代謝酶hCE2具有明顯的抑制作用，其半數(shù)抑制濃度IC50值為30.32μg/mL。2.通過桑白皮提取液的指紋圖譜可以

5、看出，有三個成分對hCE2表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用。經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品對比LC保留時間、紫外光譜和高分辨質(zhì)譜結(jié)果鑒定，這三種成分分別為桑根酮D、桑黃酮G和桑根酮C。3.三種成分對hCE2的抑制能力和類型也被檢測出來，即桑根酮D、桑黃酮G和桑根酮C對hCE2均表現(xiàn)為強(qiáng)烈的非競爭性抑制作用，抑制常數(shù)Ki分別為0.97μM、1.09μM、0.76μM。4.三種成分在桑白皮中的含量分別為576.5μg/g,98.0μg/g,781.4μg/g。