H9N2 AIV流行株全基因組序列分析及雞α干擾素與白介素18共表達(dá)產(chǎn)物的抗病毒作用研究.pdf

1、H9N2亞型禽流感病毒的廣泛流行與頻繁的變異重組，不但對(duì)養(yǎng)殖行業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，而且已經(jīng)威脅到了人類身體健康與生命安全。在1994年，我國(guó)從廣東地區(qū)分離得到第一株H9N2亞型禽流感病毒，此后，H9N2亞型禽流感病毒迅速向臨近省份蔓延。本研究在山東地區(qū)開展了H9N2亞型禽流感分子流行病學(xué)調(diào)查工作并研究了雞干擾素α和白介素18對(duì)H9N2亞型禽流感病毒的抗病毒作用。
　　 本研究對(duì)2012年實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的3株雞源H9N2亞型禽

2、流感進(jìn)行生物學(xué)特性研究。3株病毒在SPF雞胚上增值一代后，其HA效價(jià)在27～29之間，EID50在10-7.75/0.1 mL～10-8.5/0.1 mL之間，TCID50在10-8.00/0.1 mL～10-8.50/0.1 mL之間。根據(jù)GenBank公布的H9N2亞型禽流感病毒(AIV)的全基因序列設(shè)計(jì)引物，并進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送測(cè)序公司測(cè)序，完成3株山東地方分離株CK/SD/SG/2012、CK/SD/JN/201

3、2、CK/SD/SG/2012的全基因序列測(cè)序，并對(duì)3株H9N2病毒的8個(gè)基因片段(PB2，PB1，PA，HA，NP，NA，M和NS)分別進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，作出系統(tǒng)進(jìn)化樹。8個(gè)基因進(jìn)化樹中，3株病毒都處在同一個(gè)進(jìn)化位置，都屬于CK/SH/Y2/2008-like譜系，因此，推測(cè)三個(gè)H9N2分離株可能來(lái)源于CK/SH/Y2/2008-like。
　　 本研究利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，將編碼干擾素α(mChIFN-α

4、)和雞白介素18(mChIL-18)成熟蛋白基因插入pFastBacDual雙向表達(dá)載體中，分別置于PH和P10啟動(dòng)子控制之下，引入了蜂素信號(hào)肽(honeybee melittin signal peptide，HBM)基因取代雞干擾素α和及白介素18原有信號(hào)肽基因從而實(shí)現(xiàn)分泌型表達(dá)，為了可以純化蛋白在兩個(gè)基因C端分別融合了6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，將構(gòu)建成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，從而獲得重組穿梭質(zhì)粒Bacmid，轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生