煙草和楊樹核基質(zhì)附著區(qū)（MARs）的分離及其功能分析.pdf

1、　　本文采用兩種不同的方法分別從煙草和歐洲黑楊中分離出核基質(zhì)附著區(qū)，并把它們構(gòu)建到植物表達(dá)載體中，研究它們對轉(zhuǎn)基因表達(dá)的調(diào)控作用。 　　以PCR方法從煙草基因組中擴(kuò)增到兩個(gè)DNA片段(M14和M17)的序列分析表明，它們具有90﹪A-Tbox，A-box，T-box，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ識別位點(diǎn)，自主復(fù)制序列(ARS)，堿基非配對區(qū)(BUR)，MAR識別序列(MRS)，復(fù)制起始點(diǎn)(ORI)，彎曲DNA序列等典型的MAR序列特征。將它們分別構(gòu)建

2、到植物表達(dá)載體pCAMBIA2301GUS基因(uidA)表達(dá)盒一側(cè)及兩側(cè)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草。組織化學(xué)染色法定性檢測GUS活性表明，帶有M14和M17的uidA基因在轉(zhuǎn)基因煙草中穩(wěn)定表達(dá)。GUS活性的定量檢測表明，表達(dá)載體uidA基因一端或兩端連接有MAR的轉(zhuǎn)化煙草中，GUS的表達(dá)水平與對照相比都有了明顯提高，而uidA基因兩側(cè)連有MAR的載體其提高表達(dá)水平的效果優(yōu)于一端連有MAR的載體，可使GUS活性增強(qiáng)3.14倍，但不同轉(zhuǎn)化個(gè)

3、體之間表達(dá)水平的差異仍然明顯。上述結(jié)果表明，所得DNA序列為兩條新的MAR片段，并且具有提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的功能。 　　采用高鹽方法從歐洲黑楊懸浮細(xì)胞中分離到兩個(gè)DNA片段，并對它們的序列進(jìn)行了詳細(xì)的分析。發(fā)現(xiàn)它們具有MARs序列的部分特征基元如：90﹪A-Tbox，A-box，T-box，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ識別位點(diǎn)，自主復(fù)制序列，堿基非配對區(qū)，MAR識別序列，復(fù)制起始點(diǎn)，彎曲DNA序列等。將它們構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1305.1

4、中GUS基因(uidA)表達(dá)盒一側(cè)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草。組織化學(xué)染色法定性檢測GUS活性表明，uidA基因在轉(zhuǎn)基因煙草中穩(wěn)定表達(dá)。GUS活性的定量檢測表明，含有單拷貝A7、A23的轉(zhuǎn)化煙草中GUS的表達(dá)水平與對照相比，不但沒有提高，反而低于對照，說明插入的MAR片段對uidA基因的表達(dá)沒有起到增強(qiáng)作用，反而抑制其表達(dá)。 研究結(jié)果表明，MARs具有多樣性，不同的MARs可能執(zhí)行著不同的功能。有些MARs不能降低轉(zhuǎn)基因表達(dá)的差