家蠶轉(zhuǎn)基因載體pBacA3EG、pBacA4R在昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因動物研究是目前生物科學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，更是經(jīng)典遺傳學(xué)研究的模式生物之一。進(jìn)行轉(zhuǎn)基因蠶研究具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。轉(zhuǎn)基因家蠶是指用實(shí)驗(yàn)導(dǎo)入的方法使外源基因在染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定整合，并能遺傳給下一代。轉(zhuǎn)基因家蠶的研究建立在經(jīng)典遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)、結(jié)構(gòu)遺傳學(xué)和DNA重組技術(shù)的基礎(chǔ)之上。最近完成的家蠶全基因組測序工作(Xia等,2004)，將促進(jìn)家蠶的基礎(chǔ)研究，并使家蠶作為模式昆蟲對昆蟲學(xué)科的發(fā)展起到積極的推動

2、作用。在家蠶的全基因組框架圖完成之后，目前的主要工作是對家蠶基因組計(jì)劃所獲得的大量基因進(jìn)行研究，以探索其具體的生物學(xué)功能。由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)家蠶功能基因的過量表達(dá)或者基因功能的缺失，因此將成為研究家蠶基因功能的重要方法之一。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)也是利用功能基因開發(fā)新的蠶品種的關(guān)鍵，甚至還是實(shí)現(xiàn)利用家蠶合成有用蛋白質(zhì)、開發(fā)家蠶生物反應(yīng)器的技術(shù)關(guān)鍵。 本論文主要由轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建、載體表達(dá)、細(xì)胞培養(yǎng)和篩選三個(gè)部分組成。其主要研究工作包

3、括以下幾個(gè)方面： 1.根據(jù)已報(bào)道的家蠶肌動蛋白A3基因的啟動子序列設(shè)計(jì)了引物，克隆A3啟動子。通過對蠶肌動蛋白A4基因的分析，設(shè)計(jì)了3對引物：A4-1，A4-2，A4-3，最終將A4-2克隆到轉(zhuǎn)基因載體中，能夠成功啟動基因的表達(dá)。 2.以家蠶Bombyxmori肌動蛋白(actin3，A3)啟動子、增強(qiáng)性綠色熒光蛋白基因EGFP及SV40的多聚腺苷酸識別序列為元件，經(jīng)多次克隆，將其插入到piggyBac轉(zhuǎn)座載體中。經(jīng)PC

4、R、酶切鑒定及測序表明各元件已按正確的方式插入到piggyBac載體中。將構(gòu)建好的piggyBac表達(dá)載體通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染進(jìn)入家蠶BME細(xì)胞中，48小時(shí)后觀察到發(fā)紅色熒光的培養(yǎng)細(xì)胞，通過分子水平檢測，能在轉(zhuǎn)染細(xì)胞cDNA中闊增到EGFP片段，結(jié)果表明該載體構(gòu)建正確且能在細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。 3.以家蠶BombyxmoriA4啟動子、紅色熒光蛋白基因RFP及SV40的多聚腺苷酸識別序列為元件，經(jīng)多次克隆，將其插入到piggyBac轉(zhuǎn)座載體

5、中。經(jīng)PCR、酶切鑒定及測序表明各元件已按正確的方式插入到piggyBac載體中。將構(gòu)建好的piggyBac表達(dá)載體通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染進(jìn)入SF21細(xì)胞中，48小時(shí)后觀察到發(fā)紅色熒光的培養(yǎng)細(xì)胞，在48～72小時(shí)發(fā)紅色熒光細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大。通過分子水平檢測，能在轉(zhuǎn)染細(xì)胞cDNA中闊增到dsRed片段，結(jié)果表明該載體構(gòu)建正確且能在細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。 4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化：脂質(zhì)體的量在1～4ul時(shí)，轉(zhuǎn)染效率逐漸增高，在4ul時(shí)最大，進(jìn)一步加大到8

6、ul，細(xì)胞死亡嚴(yán)重，效果較差；DNA的量在0.8～1.2ug時(shí)轉(zhuǎn)染效果較好，0.4ug時(shí)轉(zhuǎn)染效率較低，DNA量增加到1.6～2.0ug，對轉(zhuǎn)染效率影響不大。綜合脂質(zhì)體和DNA的用量，當(dāng)脂質(zhì)體為4ul，DNA在0.8～1.2ug時(shí)，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高，此條件為最優(yōu)。 5.家蠶pBacA4Rfp轉(zhuǎn)基因載體穩(wěn)定表達(dá)：家蠶pBacA4Rfp轉(zhuǎn)基因載體穩(wěn)定表達(dá)較瞬時(shí)表達(dá)不同，是在轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)加入了轉(zhuǎn)座酶A3H，期望piggyBac能定向的把目

7、的基因轉(zhuǎn)座到細(xì)胞基因組中，通過復(fù)制分裂，使基因在下一代中也能表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明，pBacA4Rfp轉(zhuǎn)基因載體在轉(zhuǎn)座酶A3H的作用下，將外源DNA正確的插入到細(xì)胞基因組中，表達(dá)蛋白并且能夠穩(wěn)定的傳給下一代。經(jīng)過長時(shí)間的觀察記錄(轉(zhuǎn)染后6個(gè)月)，確定細(xì)胞一直能夠穩(wěn)定地表達(dá)紅色熒光蛋白，說明細(xì)胞能持續(xù)發(fā)光并能傳代。至本論文完稿，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞一直在做繼代培養(yǎng)，且能檢測到紅色熒光。 簡而言之，本實(shí)驗(yàn)通過載體構(gòu)建，并利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染家蠶胚胎細(xì)