嵌合TCR分子在T細(xì)胞中表達(dá)、組裝和功能的研究.pdf

1、本課題希望對(duì)結(jié)構(gòu)域替換后的嵌合TCR分子的配對(duì)組裝情況、結(jié)合CD3分子的能力、以及識(shí)別抗原和傳遞活化信號(hào)的能力的研究，為TCR基因修飾T細(xì)胞的過(guò)繼性治療研究及其臨床應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。
　　一、γδTCR基因的獲取及嵌合TCR分子生物信息學(xué)分析
　　該部分研究目的是確定αβTCR、γδTCR、CD3ζ結(jié)構(gòu)域替換位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出結(jié)構(gòu)穩(wěn)定合理的嵌合TCR分子。
　　結(jié)果顯示IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析確定了我們篩選分離獲得的TCRα1

2、2、β7、γ9和δ2鏈V-D-J或V-J連接區(qū)基因共同編碼的CDR3高變區(qū)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示在V結(jié)構(gòu)域的CDR3高變區(qū)后都存在一個(gè)折疊區(qū)域，之后以一段loop形式與TCR的C區(qū)結(jié)構(gòu)域相連接。綜合比較幾種跨膜軟件預(yù)測(cè)結(jié)果，確定了TCRα12、β7、γ9、δ2和CD3ζ的跨膜區(qū)域。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)TCRα12與TCRδ2結(jié)構(gòu)的同源性較高，TCRβ7和TCRγ9結(jié)構(gòu)的同源性較高，并與預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較最終確定了結(jié)構(gòu)域替換的位點(diǎn)。對(duì)嵌合

3、TCR分子的三維建模結(jié)果顯示，嵌合TCR分子能維持原αβTCR蛋白V區(qū)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。
　　因此，該部分通過(guò)生物信息學(xué)分析確定了結(jié)構(gòu)域替換位點(diǎn)成功設(shè)計(jì)了4種嵌合TCR分子，且這些嵌合TCR分子的結(jié)構(gòu)域具有良好的穩(wěn)定性。
　　二、嵌合TCR分子的克隆以及腺病毒的包裝
　　本部分的研究目的是構(gòu)建一組可用于FRET檢測(cè)的含熒光蛋白的嵌合TCR分子雙表達(dá)載體，以及一組不含熒光蛋白的嵌合TCR腺病毒穿梭載體并包裝出具有感染能力的腺病

4、毒。
　　結(jié)果成功設(shè)計(jì)了4套重疊PCR引物，并通過(guò)重疊PCR一步法成功獲得chimTCRα和chimTCRβ的融合基因;成功構(gòu)建了4種含熒光蛋白的真核雙表達(dá)載體pIRES-chimTRBYFP-chimTRACFP;成功構(gòu)建了4種不含熒光蛋白的腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315-chimTRB-IRES-chimTRA，并包裝出了具有感染能力的重組腺病毒，通過(guò)PCR驗(yàn)證chimTCRs整合至病毒基因組中;4種重組嵌合腺病毒的滴度都在109

5、IU/ml以上，并可有效轉(zhuǎn)染Jukat細(xì)胞，以MOI=100(PFU)感染時(shí)間為48h時(shí)，嵌合TCR的表達(dá)效率最高。
　　因此，本部分成功構(gòu)建了含熒光蛋白的4種嵌合TCR分子的雙表達(dá)載體，另外成功構(gòu)建了不含熒光蛋白的嵌合TCR腺病毒穿梭載體并包裝出了具有感染能力的重組嵌合腺病毒。
　　三、嵌合TCR分子的表達(dá)和配對(duì)組裝分析
　　本部分的目的是研究嵌合TCR分子在受體細(xì)胞的表達(dá)水平、自身的配對(duì)能力以及與內(nèi)源TCR分子的錯(cuò)

6、配程度。
　　將這4種攜帶熒光蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES-chimTRBYFP-chimTRACFP轉(zhuǎn)染BEL-7402和Jurkat細(xì)胞，并通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡掃描轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其中458nm激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)供體chimTRACFP，515 nm激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)受體chimTRBYFP，然后掃描細(xì)胞獲得熒光圖像，其中掃描ECFP通道獲得青色熒光圖象，EYFP通道獲得黃色熒光圖象。然后利用致敏受體發(fā)射方法(sensitizedaccep

7、tor emission method，SE)進(jìn)行分析獲得pFRET和FRET效率熒光圖片，接著每個(gè)樣本選擇4組細(xì)胞的FRET效率熒光圖片，并在每組細(xì)胞FRET效率熒光圖片上隨機(jī)選取5個(gè)興趣點(diǎn)(ROI)的熒光值進(jìn)行進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較各嵌合TCR分子的相互作用，確定其與內(nèi)源TCR的錯(cuò)配情況。將4種不攜帶熒光蛋白的嵌合TCR重組腺病毒轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞，72h后收獲細(xì)胞，并以TCRVβ7-PE、TCR Vα12-FITC抗體染色，流

8、式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各嵌合TCR分子Vβ7和Vα12的表達(dá)。
　　結(jié)果顯示4種攜帶熒光蛋白的嵌合TCR分子能定位于細(xì)胞膜表面并正常表達(dá)，特別是chim4TCR在沒(méi)有CD3分子存在的情況下也能非常強(qiáng)烈的表達(dá)于細(xì)胞表面，這意味著chim4TCR在細(xì)胞中的表達(dá)可以不依賴于CD3分子。SE-FRET以及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，chim1TCR和chim2TCR在兩種細(xì)胞的FRET效率都高于wtTCR，但是依然與內(nèi)源TCR產(chǎn)生了少量的雜合TCR分子。雖然c

9、him1TCR和chim2TCR在Jurkat細(xì)胞中不能避免錯(cuò)配，但相比于wtTCR在一定程度上減少了錯(cuò)配。chim3TCR和chim4TCR在BEL-7402細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞的FRET效率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這提示chim3TCR和chim4TCR能避免錯(cuò)配。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)chim1TCR、chim2TCR和chim4TCR在Jurkat細(xì)胞表面的表達(dá)水平高于wtTCR，而chim3TCR在Jurkat細(xì)胞表面的表達(dá)效率最低，

10、特別是chim4TCR相比于未經(jīng)改造的wtTCR及其他3種嵌合TCR其表面表達(dá)水平大大提高。
　　因此，該部分研究表明chim4TCR不僅能夠避免與內(nèi)源TCR的錯(cuò)配，且其在T細(xì)胞系以及非T細(xì)胞系表面表達(dá)水平都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于另3種chimTCR分子和wtTCR分子。chim3TCR雖然能避免錯(cuò)配但是表達(dá)水平卻相比于wtTCR有所下降。chim1TCR和chim2TCR其表達(dá)相比于wtTCR稍有提高但是不能避免錯(cuò)配。
　　四、嵌合TC

11、R基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞功能的研究
　　該部分的目的是研究各chimTCR分子與CD3ζ的相互作用及信號(hào)傳遞能力，分析各chimTCR分子轉(zhuǎn)染T細(xì)胞后對(duì)腫瘤細(xì)胞的CTL效應(yīng)及細(xì)胞因子分泌情況以探討其抗原識(shí)別能力，最后檢測(cè)了chim4TCR在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)初始狀態(tài)。
　　通過(guò)第一章生物信息學(xué)分析的各TCR與CD3ζ的跨膜區(qū)域和胞內(nèi)區(qū)域，設(shè)計(jì)了能采用FRET方法分析TCR與CD3ζ相互作用的一對(duì)攜帶熒光蛋白的質(zhì)粒。構(gòu)建了作為供體的4種pI

12、RES-chimTRB-chimTRACFP質(zhì)粒和作為受體的pIRES-CD3ζTMYFP和pIRES-CD3ζYFP重組質(zhì)粒。將以上質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染BEL-7402細(xì)胞，激光共聚焦掃描顯微鏡掃描CFP和YFP在BEL-7402細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，SE-FRET分析嵌合TCR與CD3ζ的相互作用。分離健康人PBMC，并篩選出HLA-A2+陽(yáng)性樣本，將wtTCR及4種chimTCR的重組腺病毒轉(zhuǎn)染PBMC并設(shè)未轉(zhuǎn)染TCR對(duì)照組，72h后與HLA-

13、A2+的靶細(xì)胞HepG-2，Huh-1以及HLA-A2-的靶細(xì)胞BEL-7402以效靶比30∶1～1∶1共孵育，作用4h后采用鈣黃綠素(Calcein-acetoxymethyl，CAM)釋放法檢測(cè)各組TCR轉(zhuǎn)PBMC對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng);24h后ELISA檢測(cè)各組TCR轉(zhuǎn)PBMC的IFN-γ分泌水平。最后分別轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒chim4TCRYFP或CD3ζYFP至BEL-7402和Jurkat細(xì)胞，采用DiD對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行染色，激光共聚焦掃

14、描顯微鏡以515nm激發(fā)波長(zhǎng)和635nm激發(fā)波長(zhǎng)分別激發(fā)YFP和DiD，發(fā)射波長(zhǎng)由500nm～700nm掃描細(xì)胞獲得熒光圖像，之后通過(guò)細(xì)胞膜共定位分析chim4TCR在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)初始狀態(tài)。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。應(yīng)用SPSS(R) v19.0軟件(SPSS Inc.，Chicago，USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各指標(biāo)先進(jìn)行正態(tài)性及Levene's test方差齊性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)比較采用析因設(shè)計(jì)，分析兩種干預(yù)交互作用、

15、單獨(dú)效應(yīng)及主效應(yīng)。采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)完成單因素?cái)?shù)據(jù)分析，多重比較使用LSD法。當(dāng)P＜0.05時(shí)，被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果顯示wtTCR和前3種嵌合γδTCR的chimTCR分子與CD3ζTM的FRET效率較低，提示這些TCR與CD3ζ在BEL-7402細(xì)胞中的相互作用較弱。而chim4TCR與CD3ζ能明顯檢測(cè)到FRET，提示chim4TCR中融合的CD3ζ依然能與CD3ζ有一定的相互作用，但是其程度低于chi

16、m4TCRαζ和chim4TCRβζ之間的相互作用。另外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明chim4TCR、chim1TCR和wtTCR轉(zhuǎn)染PBMC細(xì)胞能有效殺傷HLA-A2+的靶細(xì)胞，其中chim4TCR對(duì)靶細(xì)胞的裂解能力高于chim1TCR和wtTCR。但是chim2TCR和chim3TCR轉(zhuǎn)PBMC與未轉(zhuǎn)TCR的PBMC對(duì)HLA-A2+的靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示chim2TCR和chim3TCR可能在識(shí)別特異性抗原或信號(hào)傳遞方面能力受

17、損。各組chimTCRs以及wtTCR轉(zhuǎn)染T細(xì)胞對(duì)HLA-A2-的靶細(xì)胞沒(méi)有表現(xiàn)出殺傷效應(yīng)。此外作用于HLA-A2+的靶細(xì)胞后，chim4TCR、wtTCR和chim1TCR基因轉(zhuǎn)染PBMC能分泌的IFN-γ，其中chim4TCR基因轉(zhuǎn)染組分泌的IFN-γ高于wtTCR和chim1TCR基因轉(zhuǎn)染組，而chim2TCR和chim3TCR與未經(jīng)轉(zhuǎn)染TCR的對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。作用于HLA-A2-的靶細(xì)胞BEL-7402后，IFN-γ分泌

18、水平均沒(méi)有顯著性差異。最后通過(guò)細(xì)胞膜共定位分析發(fā)現(xiàn)Chim4TCR或CD3ζ都共定位于膜上，確定了Chim4TCR在T細(xì)胞內(nèi)信號(hào)屬于未活化的初始狀態(tài)。
　　因此，該部分研究證實(shí)Chim4TCR依然能與CD3ζ有一定的相互作用;Chim4TCR、chim1TCR依然保持原wtTCR的HLA-A2限制性，并具有良好的抗原特異性及信號(hào)傳遞能力，chim2TCR和chim3TCR可能失去了抗原識(shí)別能力或是信號(hào)傳遞能力受損而不足以促進(jìn)細(xì)胞因