外周血單個(gè)核細(xì)胞中風(fēng)濕病相關(guān)基因的鑒定與評(píng)價(jià).pdf

1、風(fēng)濕病是一組以肌肉、關(guān)節(jié)疼痛為主要特征的疾病，大多數(shù)風(fēng)濕病的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明了，不同種類的風(fēng)濕病患者具有某些相同的癥狀，這一現(xiàn)象提示各種風(fēng)濕病間可能存在相同的病理機(jī)制。已有研究表明遺傳因素在風(fēng)濕病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。目前，基因差異表達(dá)分析已廣泛應(yīng)用于各種類型的風(fēng)濕病，鑒定出了大量的風(fēng)濕病相關(guān)基因，并且發(fā)現(xiàn)不同種類的風(fēng)濕病存在相同的遺傳因素。然而，目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)風(fēng)濕病共同遺傳因素的研究較少，且多數(shù)研究納入的風(fēng)濕病種類少，因此還需要

2、更多更系統(tǒng)的研究來(lái)探討風(fēng)濕病的共同遺傳因素，從分子水平為風(fēng)濕病的共同機(jī)制研究提供線索。
　　目的:
　　1.從人類外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral bloodmononuclearcells,PBMCs）中鑒定不同風(fēng)濕病的共同差異表達(dá)基因，并探討其相互作用及生物學(xué)功能；
　　2.收集風(fēng)濕病患者及未患有任何風(fēng)濕病的對(duì)照樣本，驗(yàn)證所鑒定的基因，并比較分析它們判別風(fēng)濕病患者和非風(fēng)濕病對(duì)照的能力；
　　3.對(duì)于經(jīng)驗(yàn)

3、證的基因，進(jìn)一步鑒定相關(guān)的表觀遺傳調(diào)控因子。
　　方法:
　　1.從PubMed和基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene expression Ominibus，GEO）搜索獲得風(fēng)濕病相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，搜索范圍包括23種臨床常見(jiàn)的風(fēng)濕性疾病。
　　2.公共數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源的數(shù)據(jù)處理分析方法：采用 R軟件的 MetaDE軟件包進(jìn)行各基因表達(dá)數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)預(yù)處理和分析?；虿町惐磉_(dá)分析采用 t檢驗(yàn)，用Benjamini&Hochberg FD

4、R法進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正。采用STRING9.1進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析，用AmiGo2進(jìn)行基因功能富集分析。
　　3.重復(fù)驗(yàn)證樣本：本研究共納入27例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）患者及18例未診斷為任何風(fēng)濕病的對(duì)照。RA患者來(lái)自蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科門診，對(duì)照來(lái)自蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部。每位志愿者捐獻(xiàn)10ml外周血用于芯片實(shí)驗(yàn)。
　　4.由培訓(xùn)合格的調(diào)查員收集RA患者及對(duì)照的一般人口統(tǒng)計(jì)學(xué)資料、

5、生活方式、既往病史及現(xiàn)病史，以及 RA患者的C反應(yīng)蛋白、關(guān)節(jié)腫脹和壓痛數(shù)等疾病相關(guān)信息。由專業(yè)醫(yī)務(wù)人員采集研究對(duì)象的外周血，由經(jīng)過(guò)統(tǒng)一培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)人員用淋巴細(xì)胞分離液提取PBMCs進(jìn)行芯片實(shí)驗(yàn)。mRNA、miRNA和DNA甲基化水平分別采用Agilent LncRNA& mRNA microarray、Affymetrix miRNA4.0和Illumina450K DNA甲基化芯片檢測(cè)。
　　5.應(yīng)用SPSS21進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，基因

6、差異表達(dá)分析采用雙側(cè)t檢驗(yàn)。用Medcalc軟件繪制ROC曲線并比較分析各基因判別RA和對(duì)照的效能。采用TarBase數(shù)據(jù)庫(kù)和 Targetscan軟件獲得調(diào)控基因表達(dá)的候選 miRNA，用 Pearson’s相關(guān)分析miRNA與mRNA表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)，以及mRNA與DNA甲基化水平的關(guān)聯(lián)。用Cytoscape軟件繪制基因、miRNA和DNA甲基化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　結(jié)果:
　　1.從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)篩選獲得6個(gè)風(fēng)濕病相關(guān)基因表達(dá)

7、數(shù)據(jù)集，包括4種常見(jiàn)的風(fēng)濕病：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、骨關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎。另外，本研究還納入了27例處于病情活動(dòng)期的RA患者及18例非風(fēng)濕病對(duì)照，均為女性。RA患者的平均年齡為47.33±10.91歲,非風(fēng)濕病對(duì)照組的平均年齡為47.11±14.09歲。兩組研究對(duì)象年齡差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.06，P=0.953）。
　　2.通過(guò)基因差異表達(dá)分析鑒定出八個(gè)基因（TNFSF10、CX3CR1、LY96、TLR5、TXN

8、、TIA1、PRKCH、PRF1），每個(gè)基因至少在所納入的4種風(fēng)濕病中的3種中有差異表達(dá)。
　　3.通過(guò)蛋白質(zhì)相互作用分析發(fā)現(xiàn)所鑒定的八個(gè)基因存在廣泛的文本關(guān)聯(lián)，有三對(duì)基因存在共表達(dá)關(guān)系：CX3CR1/PF1、TLR5/TNFSF10和TNFSF10/PRKCH。在整個(gè)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中，基因CX3CR1、PRF1、TLR5和TNFSF10作為網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)將八個(gè)基因聯(lián)系在一起。
　　4.對(duì)所鑒定的八個(gè)基因的功能富集分析結(jié)果顯示它們主要

9、富集于免疫相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞防御反應(yīng)、機(jī)體對(duì)細(xì)菌和細(xì)菌相關(guān)物質(zhì)的反應(yīng)等。
　　5.在新的人群中的驗(yàn)證結(jié)果顯示，TNFSF10、TXN、TLR5和TIA1的表達(dá)量為RA病例組高于對(duì)照組（P<0.05）；LY96、PRKCH、CX3CR1和PRF1的表達(dá)量在兩組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　6.應(yīng)用ROC曲線分析TNFSF10、TXN、TLR5和TIA1區(qū)分RA和對(duì)照的效能，其 AUC分別為0.882（95

10、％CI:0.750-0.959）、0.835（95%CI：0.695-0.929）、0.817（95%CI：0.673-0.916）、0.689（95%CI：0.534-0.819），四個(gè)基因聯(lián)合應(yīng)用時(shí)AUC為0.909（95%CI：0.786-0.974）。AUC最大的基因?yàn)?TNFSF10，它與TXN和TLR5的AUC差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）,與AUC最小的基因TIA1的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。四個(gè)基因聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的

11、ROC曲線下面積大于各個(gè)基因單獨(dú)作用，但是只與基因TIA1的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　7.對(duì)于TNFSF10、TXN、TLR5和TIA1,本研究共鑒定出56對(duì)負(fù)相關(guān)的miRNA-靶基因,調(diào)控各基因的miRNA數(shù)量分別為7、2、17和31。其中，hsa-miR-4443和hsa-miR-142-5p均同時(shí)調(diào)控TIA1、TLR5和TNFSF10三個(gè)基因。Hsa-miR-3609調(diào)控TIA1、TXN和TLR5。Hsa-mi

12、R-342-3p和hsa-miR-3185均同時(shí)調(diào)控基因TIA1和TLR5。
　　8.TLR5的表達(dá)水平與其5’非翻譯區(qū)的甲基化位點(diǎn)cg17938489的甲基化水平呈正相關(guān)。TNFSF10的表達(dá)水平與其 Body區(qū)的 cg01059398和 TSS1500區(qū)的cg22572614的甲基化水平呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.不同類型的風(fēng)濕病之間存在共同的遺傳因素，本研究針對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強(qiáng)直性脊柱炎和骨關(guān)

13、節(jié)炎共鑒定出8個(gè)共同差異表達(dá)基因。八個(gè)基因主要富集于免疫相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程。
　　2.所鑒定的8個(gè)基因中有4個(gè)在RA患者PBMCs中得到驗(yàn)證，它們均有一定的區(qū)分RA患者和非風(fēng)濕病對(duì)照的能力。其中TNFSF10在病例和對(duì)照中差異表達(dá)較顯著，且判別病例和對(duì)照的能力較強(qiáng)。
　　3．經(jīng)驗(yàn)證的四個(gè)基因與相關(guān)的48個(gè)miRNA和3個(gè)甲基化位點(diǎn)可能在RA的發(fā)病中發(fā)揮作用。
　　4．對(duì)于本研究鑒定的8個(gè)風(fēng)濕病共同差異表達(dá)基因，還需要在更